专利名称：一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法,特别涉及可用于丙型肝炎筛查和丙型肝炎病毒分型的引物组合物。
背景技术：
丙型肝炎(hepatitis C ；HC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus ；HCV)感染而导致的一种复杂的病理过程。HC呈世界分布，目前全世界有近2亿人感染HCV，占世界人口的3% -5%。2003至2008年我国丙肝新报告的病例数以及与丙肝相关的肝癌发病率逐年增加，在法定报告的27种传染病中，其发病率由2004年的第十位上升至2008年第七位，目前我国约有丙肝患者4000万。HCV基因组长度约9. 6kb，仅含有单个开放阅读框架(ORF)，编码一条长约3100个·氨基酸残基的多聚蛋白前体。在宿主细胞和病毒蛋白酶的作用下，多蛋白被加工成至少10个成熟的 HCV 蛋白质C、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 核心蛋白由191个氨基酸残基组成，与HCV RNA结合后形成病毒核心。目前，第四代抗-HCV检测试剂主要有C、NS3、NS4、NS5抗原片段。由于HCV极易变异，相应其所表达的蛋白也发生变化，在实际检测中会产生弱阳性和假阴性现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法。本发明提供的第一种引物组合物，可用于丙型肝炎患者辅助筛查，包括序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示 DNA。本发明提供的第二种引物组合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所7]n DNA、序列表的序列3所不DNA、序列表的序列4所不DNA、序列表的序列5所不DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者辅助筛查；(b)丙型肝炎病毒辅助分型。本发明提供的第三种引物组合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者辅助筛查；(b)丙型肝炎病毒辅助分型。所述第一种引物组合物、所述第二种引物组合物或所述第三种引物组合物可用于制备丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒。所述第二种引物组合物或所述第三组引物组合物可用于制备丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒。本发明还保护一种丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒，包括所述第一种引物组合物、所述第二种弓I物组合物或所述第三种弓I物组合物。本发明还保护一种丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒，包括所述第二种引物组合物或所述第三种引物组合物。本发明还保护一种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤(I)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；(2)以步骤⑴的扩增产物为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对乙为序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；(3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为引物对丙；所述引物对丙为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。所述步骤(2)中，所述扩增产物具体可为450bp。·本发明还保护另一种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤(I)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用所述引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；(2)以步骤⑴的扩增产物为模板，用所述引物对丙进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为所述引物对丙。所述丙型肝炎病毒具体可为Ib型、Ia型、6a型、3a型或2a型。HCV的早期诊断与基因分型是传染病防控与临床工作的难点。本研究选择巢式PCR对HCV核心蛋白的编码基因进行扩增和测序，从而对HCV进行基因水平的分型。巢式PCR是为扩增一个低拷贝片段而进行两次聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段是扩增包括目的片段在内的比目的片段还长的片段。第二对引物(称为巢式引物)能够与第一次PCR产物内部结合，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于能够扩增出比普通PCR更难扩增的片段，而且如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。第三代第四代HCV ELISA试剂盒中关键成份之一就是对HCV核心蛋白的检测。本发明对使用HCV ELISA试剂盒检测为抗-HCV阴性但ALT大于100U/L的血清检测发现有一例核心蛋白基因扩增阳性，说明本方法可以作为可疑HCV感染人群的辅助筛查。本发明的引物设计涉及1063条HCV Core Protein基因序列，包括6个基因型83个亚型，理论上能全部对已经发现基因型的检测和分型确认。综上所述，本发明提供的引物组合物可以用于丙型肝炎筛查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潜在应用价值。
图I为第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；1为DL2000 DNA分子质量标准；2-5均为待测血清，其中2至4显示阳性结果，5显示阴性结果。图2为I例Ib型的部分测序谱图。
图3为I例Ib型的国际HCV数据库检索结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例I、引物组合物的设计
从国际HCV 数据库(http://hcv. lanl. gov/components/sequence/HCV/search/searchi.html)查找到1063条HCV Core Protein基因序列,包括6个基因型83个亚型,利用DNAStar-Megalign分析比对找出其保守序列，并用PRMER5设计引物，然后在NCBI数据库检测其特异性。共设计并筛选得到6种引物(Cl、C2、C3、C4、C5和C6)，序列见表I。表I 6条引物(简并引物)的核苷酸序列
权利要求
1.用于丙型肝炎患者辅助筛查的引物组合物，包括序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所不DNA、序列表的序列3所不DNA和序列表的序列4所不DNA。
2.引物组合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所不DNA、序列表的序列4所不DNA、序列表的序列5所不DNA和序列表的序列6所不DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者辅助筛查； (b)丙型肝炎病毒辅助分型。
3.引物组合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者辅助筛查； (b)丙型肝炎病毒辅助分型。
4.权利要求I或2或3所述引物组合物在制备丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒中的应用。
5.权利要求2或3所述引物组合物在制备丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒中的应用。
6.一种丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒，包括权利要求I或2或3所述引物组合物。
7.—种丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒，包括权利要求2或3所述引物组合物。
8.—种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤 (1)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对； (2)以步骤(I)的扩增产物为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对乙为序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对； (3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为引物对丙；所述引物对丙为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中的所述扩增产物为450bp。
10.一种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤 (1)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对甲为序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对； (2)以步骤(I)的扩增产物为模板，用引物对丙进行PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对丙为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对； (3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为所述引物对丙。
全文摘要
本发明公开了一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法。本发明提供的引物组合物，包括序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA，还可包括序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA。本发明提供的引物组合物可以用于丙型肝炎患者筛查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潜在应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102899422SQ20111020854
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者朱玉兰, 董瑞玲, 刘胜牙, 古莉冰, 王佃鹏, 孙杰, 徐媛, 李微 申请人:深圳国际旅行卫生保健中心