专利名称：抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体dr5的人-鼠嵌合抗体及其制法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)受体(death receptor 5, DR5)的人-鼠嵌合抗体、高效表达该抗体的真核表达载体、产生该抗体的稳定细胞株、制备所述人-鼠嵌合抗体的方法及所述人-鼠嵌合抗体及其组合物的用途。
背景技术：
死亡受体5 (death receptor 5, DR5)是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosis factor related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的受体，其胞内区含有 死亡结构域。DR5与天然配体TRAIL结合后能有效激活细胞凋亡信号转导途径，导致细胞死亡。前期研究证明，鼠源的功能性抗DR5的单克隆抗体能够诱导体外培养的多种肿瘤细胞死亡，体内能有效抑制肿瘤生长，并对正常组织和细胞没有毒性(Guo Y et al.，A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity inducescaspase-dependent and caspase-independent cell death J Biol Chem 2005 ；280 (51)41940-52)。但是，利用杂交瘤技术制备的该单克隆抗体为鼠源的异种免疫球蛋白，直接用于人类肿瘤的治疗，可能引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody, HAMA)反应,削弱其治疗效果并对人体产生有害作用。因此，将鼠源抗体进行修饰改造，降低其对人体的免疫原性是将所述抗体成功应用于制药用途的必要途径。常见的鼠源抗体改造途径包括嵌合和人源化。人-鼠嵌合抗体是利用基因工程技术将鼠源性抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，构建成完整的嵌合抗体，可以在保持原单抗特异性和亲和力的基础上，减少人抗鼠抗体反应，延长其半衰期和改善药代动力学特性。哺乳动物细胞表达系统可以高效产生具有正确的折叠、装配、空间构象和良好生物学效应的完整抗体分子，是嵌合抗体最理想的表达体系，而真核表达载体的构建和宿主细胞的选择对嵌合抗体的表达水平非常重要。理想的真核表达载体需要强的启动子和适当的筛选标志，既有利于基因本身的扩增，又可以作为阳性细胞的筛选。因此，本发明的技术问题在于利用嵌合抗体技术制备抗DR5人-鼠嵌合抗体。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于提供一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体(DR5)的人-鼠嵌合抗。因此，本发明的第一方面涉及一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO :1所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO :2所示的重链可变区(VH)氨基酸序列，所述嵌合抗体的恒定区为人抗体的恒定区。
优选地，所述嵌合抗体的重链恒定区为人IgGl的恒定区，轻链恒定区为人K链。优选地，所述嵌合抗体的轻链可变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别为CDRl 的 24 位到 39 位氨基酸RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO 3)；CDR2 的 55 位到 61 位氨基酸KVSNRFS (SEQ ID NO 4)；CDR3 的 94 位到 102 位氨基酸FQSTHVPHT (SEQ ID NO 5);和 / 或所述嵌合抗体的重链可变区⑶R11、⑶R22和⑶R33的氨基酸序列分别为CDRll 的 31 位到 35 位氨基酸DFSMN(SEQ ID NO 6)；CDR22 的 55 位到 66 位氨基酸WINTETGEPTYADDFKG(SEQ ID NO 7)； CDR33 的 99 位到 101 位氨基酸IDY (SEQ ID NO 8)。最优选地，所述嵌合抗体由2011年6月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4938的稳定细胞株表达，命名为Zaptuximab。本发明的第二方面涉及一株稳定表达抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的稳定细胞系，分类名称为稳定表达抗DR5人-鼠嵌合抗体CHO细胞株，于2011年6月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC No. 4938。本发明的第三方面涉及一种稳定表达如本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体，其特征在于所述重组真核表达载体带有CAG强启动子和二氢叶酸还原酶筛选标记，来自鼠抗人DR5的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的编码序列、人IgGl重链恒定区和轻链恒定区K链的序列以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A序列被有效连接以高效表达所述的人-鼠嵌合抗体，优选地，所述重组真核表达载体的起始质粒为PCDNA3，优选地，所述鼠抗人DR5的单克隆抗体为AD5-10 (Guo Y et al. , A novel anti-human DR5monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspase-dependent andcaspase-independent cell death J Biol Chem 2005 ；280 (51) :41940-52)。优选地，来自鼠抗人DR5的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的编码序列、人IgGl重链恒定区和轻链恒定区K链的序列以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A序列的连接起来的序列如SEQ ID N0:9所示。本发明的第四方面涉及一种制备如本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤A)用如本发明第三方面所述的稳定表达如本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体转染CH0-dhfr_ 细胞；B)利用氨甲蝶呤加压筛选获得稳定表达嵌合抗体的细胞株。本发明的第五方面涉及一种如本发明第四方面所述的方法获得的稳定细胞株。本发明的第六方面涉及一种组合物，其活性成分为如本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体与化疗药物组成，优选地，所述化疗药物是TRAIL或表柔比星。本发明的第七方面涉及如本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体、如本发明第三方面所述的稳定表达本发明第一方面所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体或根据本发明第六方面所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌或肺癌。换言之，为了完成本发明的目的，本发明提供一种人-鼠嵌合抗体，其轻链和重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO :1的轻链可变区(VL)的氨基酸序列和SEQ ID NO 2的重链可变区(VH)的氨基酸序列。所述嵌合抗体的轻链可变区⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的氨基酸序列分别为CDRLl (24 位到 39 位氨基酸):RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO 3)，CDRL2 (55 位到 61 位氨基酸)KVSNRFS (SEQ ID NO 4)， CDRL3 (94 位到 102 位氨基酸)FQSTHVPHT (SEQ ID NO :5)，所述嵌合抗体的重链可变区⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3的氨基酸序列分别为CDRHl (31 位到 35 位氨基酸)DFSMN(SEQ ID NO 6)，CDRH2 (50 位到 66 位氨基酸):WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO 7)，CDRH3 (99 位到 101 位氨基酸)IDY (SEQ ID NO 8)。本发明还提供一种抗DR5胞外区的人-鼠嵌合抗体的制备方法，该嵌合抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO: I的轻链可变区(VL)的氨基酸序列和SEQID NO :2的重链可变区(VH)的氨基酸序列。其轻链恒定区为人K链，重链恒定区亚型为人IgGl。该方法包括以下步骤以抗人DR5的单链抗体(scFv)原核表达载体pET15b-AD5scFVDNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增抗DR5嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区基因片段，分别与人IgGl重链恒定区和K链连接后，再用重叠PCR将人-鼠嵌合抗体的重链和轻链相连接，并在重链和轻链之间加入具有自我剪切功能的Furin/2A序列。以P⑶NA3为原始载体，构建一个新的含有CAG启动子和二氢叶酸还原酶(dhfr)筛选标记的真核表达载体，将上述人-鼠嵌合抗体的基因克隆到此载体，构建抗DR5人-鼠嵌合抗体的真核表达载体。本发明获得的新的表达载体，以具有自我剪切功能的Furin/2A序列将嵌合抗体的重链和轻链连接在一个开放阅读框内。用抗DR5人-鼠嵌合抗体的真核表达载体转染CH0-dhfr_细胞，经氨甲蝶呤(MTX)梯度加压筛选获得稳定高效表达嵌合抗体的细胞株。能够同时、均衡、匹配地表达嵌合抗体的重链和轻链，并自动组装成功能完整的抗人DR5的人-鼠嵌合抗体，命名为Zaptuximab。经本发明的方法获得的稳定CHO细胞株，已于2011年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其分类名称为稳定表达抗DR5人-鼠嵌合抗体CHO细胞株，其编号为CGMCC No. 4938。本发明所述的稳定CHO细胞株能够产生人-鼠嵌合抗体，其嵌合抗体抗体免疫球蛋白的亚型是IgGl。该抗DR5人-鼠嵌合抗体和DR5的天然配体TRAIL均可与DR5结合，但其结合位点不同。体外的研究表明，该抗DR5人-鼠嵌合抗体可杀死白血病、肝癌、结肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞，杀伤力呈时间和剂量依赖关系。体内的研究表明，该抗DR5人-鼠嵌合抗体能强烈地抑制人结肠癌、肝癌和肺癌等肿瘤细胞在裸鼠体内生长，并且能与表柔比星等化疗药物联合应用，达到更好的治疗效果。停药后未见明显的反弹现象，组织学分析未见引起小鼠肝脏肾脏等器官病理性变化。本发明稳定CHO细胞株产生在体外具有强烈的杀伤肿瘤细胞作用的人-鼠嵌合抗体Zaptuximab。该嵌合抗体与表柔比星或其它化疗药物具有协同杀伤肿瘤细胞的作用，并且在体内可抑制人多种移植瘤在裸鼠体内的形成和生长。所述稳定细胞株产生的人-鼠嵌合抗体Zaptuximab诱导细胞凋亡和自噬性死亡两种不同的细胞死亡形式。本发明还提供本发明所述的人-鼠嵌合抗体Zaptuximab在制备治疗肿瘤药物中的用途。本发明进一步提供一种本发明所述的人-鼠嵌合抗体及其人源化的改型抗体。 最后，本发明还提供一种所述的人-鼠嵌合抗体或其至少80%同源性，优选至少85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %同源性的同源序列与药学上可接受的载体重组后获得的重组表达载体在制备治疗肿瘤的基因治疗药物中的应用。由此可见，在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，构建了稳定表达抗人DR5的人-鼠嵌合抗体的真核表达载体，进而将此载体稳定转染CH0-dhfr_细胞，经氨甲蝶呤加压筛选后，获得了稳定细胞株，能够表达一种新型的抗DR5的人-鼠嵌合抗体Zaptuximab。在体外，该嵌合抗体具有强烈诱导多种肿瘤细胞凋亡的能力；在裸鼠体内，该嵌合抗体具有显著抑制人肿瘤细胞形成肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的生物学活性；该嵌合抗体可与其它抗癌药物联用，在体内外诱导肿瘤细胞死亡，加强化疗药物的疗效，降低化疗药物的剂量和毒副作用。因此，该人-鼠嵌合抗体在新型抗肿瘤药物研制中具有重要意义。本发明的优点与效果是获得了一株前人没有报道的抗DR5人-鼠嵌合抗体及其真核表达载体和稳定表达细胞。所述真核表达载体的基因表达调控元件包括强启动子CAG启动子、dhfr筛选标记及Furin/2A自剪切序列，在所述真核表达载体中，嵌合抗体的重链和轻链被连接在一个开放阅读框内，能够同时、均衡、匹配地表达嵌合抗体的重链和轻链，并自动组装成功能完整的嵌合抗体分子。用所述真核表达载体稳定转染CHO-dhfr—细胞后，经MTX加压筛选，获得一株稳定表达抗DR5嵌合抗体的CHO细胞株。该人-鼠嵌合抗体同DR5结合的位点与TRAIL不同，可与TRAIL及表柔比星等化疗药物联合作用，协同增强其抗肝癌、肺癌和结肠癌等肿瘤的效果。在体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无毒副作用。在体内具有强烈的抑制人肝癌、肺癌和结肠癌细胞生长的生物学活性，对正常小鼠的肝脏、肾脏等器官无毒副作用。显示了该嵌合抗体可发展为安全、有效的抗肿瘤药物，以该嵌合抗体序列或进一步的人源化改型抗体序列与药学上可接受的载体重组连接，获得的重组表达载体可用于制备治疗肿瘤的基因治疗药物。抗DR5人-鼠嵌合抗体是利用基因工程技术将鼠源性抗DR5抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，构建成完整的嵌合抗体，可以在保持原单抗特异性和亲和力的基础上，减少人抗鼠抗体反应，延长其半衰期和改善药代动力学特性，并能有效地活化补体和Fe受体相关的效应系统。本发明将我们制备的一株鼠源功能性抗人DR5单克隆抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，建立人-鼠嵌合抗体，并在哺乳动物细胞中稳定表达，获得稳定表达该新型人-鼠嵌合抗体的细胞株。该抗体在体内外对多种肿瘤细胞具有特异性的凋亡诱导活性，对正常细胞和组织没有毒副作用，可单独或与TRAIL或其它化疗药物联用，用于多种肿瘤和其它与DR5表达异常相关疾病的治疗。
图I :是构建的新的带有CAG启动子和dhfr筛选标记的高效表达抗DR5人-鼠嵌合抗体的真核表达载体。图2 :是稳定表达该嵌合抗体的CHO细胞株经MTX加压筛选后，该嵌合抗体表达水平的检测结果。图3 :是显示该嵌合抗体与其抗原人DR5的结合情况。图中显示该嵌合抗体与DR5的结合呈典型的单位点结合模式，Kd = I. InM,数据处理采用GraphPad软件。图4 :是显示该嵌合抗体在体外杀伤肿瘤细胞的活性。A图显示以不同浓度的该嵌合抗体处理人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞24小时的细胞存活率；B图显示以不同浓度的 该嵌合抗体处理人肝癌SMMC-7721细胞24小时的细胞存活率；C图显示以不同浓度的该嵌合抗体处理人结肠癌HCT116细胞24小时的细胞存活率；D图显示不同浓度的该嵌合抗体处理人肝癌BEL-7402细胞24小时的细胞存活率；E图显示不同浓度的该嵌合抗体处理人非小细胞肺癌H460细胞24小时的细胞存活率。细胞存活率采用MTS试剂盒(Promega公司，G1112)测定。图5 :是显示该嵌合抗体及其联合化疗药物在裸鼠体内抑制人移植肿瘤形成及生长的活性。A图显示该嵌合抗体及其联合化疗药物抑制人肝癌BEL-7402细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长；B图显示嵌合抗体及其联合化疗药物抑制人结肠癌HCT116细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长；C图显示嵌合抗体及其联合化疗药物抑制人非小细胞肺癌H460细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长。EPB表示化疗药物表柔比星。图6 :是显示该嵌合抗体在人肝癌、结肠癌和非小细胞肺癌细胞中激活Caspase级联并导致 Caspase 底物 PARP (polyADP-ribose polymerase)降解的活性。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实验例I新的带有CAG启动子和dhfr筛选标记的高效表达抗DR5的人-鼠嵌合抗体的真核表达载体的构建以抗人DR5单链抗体(scFv)原核表达载体pET15b_AD5scFv DNA (Guo Y etal. ， A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activityinduces caspase-dependent and caspase-independent cell death J Biol Chem2005 ；280(51) :41940-52)为模板，PCR扩增抗DR5嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区基因片段(VH 引物，重链上游引物 VHE : 5 ’ CGGAATTCCAGATCCAGTTG3，(SEQ ID NO 10)，下游引物 VHS :5，ATGTGTCGACGCTGAGGAGACTGT3，(SEQ ID NO 11) VL 弓丨物，轻链上游引物 VLE :5’ GCGGAATTCGATGTTGTGATG3’ (SEQ ID NO : 12)，下游引物 VLS 5’ACGCGTCGACCCGTTTTATTTC3’(SEQ ID NO : 13)，插入带有人 IgGl 重链恒定区和 κ 链(通用序列)的载体(pCI-neo，Promega Co.，E1841)，再用重叠PCR将人-鼠嵌合抗体重链和轻链相连接(引物I :5，CCGCTCGAGG ATCCACCATGGAGACAGACACA3，(SEQ ID NO: 14)，引物2:5’ CTTGAGAAGGTCAAAGTTCAGTGTTTGCTTTACAGGTGCT CGCCTCTTCCTTTTACCCGGAGACAGG3’ (SEQ ID NO 15)，引物3:5’ CTTTGACCTTCTCAAGTTGGCTGGAGACGTTGAGTCCAATCCTGGGCCCGAGACAGACACACTC3’ (SEQ ID NO: 16)，·引物4:5’CCGAAGCTTCTAGATATCTTACTAGCACTCTCCCCTGTTG3’ (SEQ ID NO: 17))，从而在重链和轻链之间加入具有自我剪切功能的Furin/2A序列。以pCDNA3 (Invitrogen. A-150228)为原始载体，以PAM-CAG载体(香港大学提供)为模板，以上游引物5’GGCGCAGATCTATTGACGTCAAT3’ ((SEQ ID NO :18)和下游引物 5’GGCAAGCTTAATTCTTTGCCAAAATG 3’ (SEQ ID NO:19)扩增鸡肌动蛋白启动子CAG，以pSV2-dhfr载体(购自ATCC，67110)为模版，以上游引物 5’AATCCCGGGACAGCTCAGGGCTGCG3’ (SEQ ID NO 20)和下游引物 5’GGCGGCGCTTCGAAAAAGCCAGCAAAAGCTC3’ (SEQ ID NO 21)扩增二氢叶酸还原酶dhfr基因片段。将CAG、完整抗体基因HF2AL(SEQ ID NO 9)和dhfr基因片段依次插入该原始载体，经测序鉴定正确，获得新的抗DR5的人-鼠嵌合抗体的真核表达载体pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr。所得重组质粒的图谱见图I。实验例2高效稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株的建立用脂质体转染法将构建的真核表达载体pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr转染CHO-dhfr—细胞(购自ATCC，CRL-9096)，经不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的选择培养基IMDM(HyClone, SH30228. 01B)筛选阳性单克隆，获得稳定表达嵌合抗体的细胞株，经不同浓度的氨甲蝶呤MTX(5X 10_8-5X 10_7mol/L)加压筛选，获得表达产量显著提高的稳定表达该嵌合抗体的细胞株。结果见图2。该细胞株已于2011年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其分类名称为稳定表达抗DR5人-鼠嵌合抗体CHO细胞株，其编号为CGMCC No. 4938。该嵌合抗体命名为Zaptuximab。实验例3酶联免疫法(ELISA)测定嵌合抗体与其抗原的特异结合以在大肠杆菌中表达的重组人DR5包被96孔酶标板，用5%的脱脂奶粉封闭，加入不同浓度(0,7. 8,15. 6,31. 2,62. 5、125、250、500、1000、2000、4000ng/ml)的嵌合抗体或鼠源性抗DR5抗体，37°C保温2小时。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人/小鼠IgG二抗(中杉金桥),37°C保温2小时。加入显色底物，30分钟后，加入2 M硫酸终止反应，测定OD值。结果见图3,结果表明嵌合抗体Zaptuximab与DR5的结合呈典型的单位点结合模式，Kd = I. InM，亲和力与鼠源性抗DR5抗体AD5-10相比没有明显降低。实验例4 MTS法测定嵌合抗体Zaptuximab在体外对肿瘤细胞的杀伤力将对数生长期的人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞(ATCC，TIB-152)、肝癌SMMC-7721细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 52)、结肠癌HCT116细胞(ATCC，CCL-247)、肝癌BEL-7402细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 10)和非小细胞肺癌H460细胞(ATCC，HTB-177)等肿瘤细胞加入96孔细胞培养板中，加入不同浓度的嵌合抗体(0,0. 13、0. 25、0.5、1、2、4、81^/1111)，处理24小时后，力口入MTS试剂，反应2-4小时，测定OD值(波长492nm)。以无细胞孔的OD值为空白对照“O”。细胞存活率=处理孔的OD值与未处理孔OD值的比值。结果见图4。结果表明细胞存活率有显著下降，说明嵌合抗体Zaptuximab具有很强的抑制肿瘤作用。实验例5嵌合抗体Zaptu ximab在体内的杀伤肿瘤活性裸鼠(BALB/c，北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下注射BEL-7402细胞5X106/只。治疗组(η = 6)分嵌合抗体不同剂量单独治疗组，化疗药物表柔比星(EPB)单独治疗组及嵌合抗体与化疗药物联合治疗组，从接种肿瘤细胞第5日开始给药，检测嵌合抗体抑制肿瘤生长的活性。阴性对照组(η = 6)给于PBS和生理盐水。给药途径均为腹腔注射。给药29天后，处死裸鼠，取肿瘤称重。结果见图5。结果表明，嵌合抗体Zaptuximab能够显著抑制裸鼠体内人肝癌BEL-7402细胞、结肠癌HCTl 16细胞及非小细胞肺癌Η460细胞移植瘤的生长，并呈剂量依赖关系。嵌合抗体Zaptuximab联合化疗药物表柔比星Epirubicin后,其抑制肿瘤活性得到
进一步加强。实验例6 Western blot检测嵌合抗体Zaptuximab激活caspase级联并引起其底物 PARP (poly ADP-ribose polymerase)降解对数生长期的BEL-7402、HCT116及H460细胞用100ng/ml的嵌合抗体Zaptuximab处理0、4和8h，收集细胞，裂解，进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶上的蛋白转到PVDF 膜上，加入 caspase-3、caspase-8 和 PARP 的第一抗体(Cell Signaling TechnologyCo.)进行杂交。加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(HRP-山羊抗兔或小鼠IgG，中杉金桥公司)，加入发光底物显影。Western blot结果显不，caspase-8、caspase-3和PARP都发生了时间依赖的降解，证明嵌合抗体Zaptuximab可以激活caspase级联并引起其底物PARP降解(图6)。
权利要求
1.一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO :1所示的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO :2所示的重链可变区氨基酸序列，所述嵌合抗体的恒定区为人抗体的恒定区。
2.根据权利要求I所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体的重链恒定区为人IgGl的恒定区，轻链恒定区为人K链。
3.根据权利要求I或2所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为 CDRl的24位到39位氨基酸如SEQ ID NO 3所示； CDR2的55位到61位氨基酸如SEQ ID NO 4所示； CDR3的94位到102位氨基酸如SEQ ID NO 5所示；和/或 所述嵌合抗体的重链可变区⑶RH、⑶R22和⑶R33的氨基酸序列分别为 CDRll的31位到35位氨基酸如SEQ ID NO 6所示； CDR22的55位到66位氨基酸如SEQ ID NO 7所示； CDR33的99位到101位氨基酸如SEQ ID NO 8所示。
4.根据权利要求I到3任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体由2011年6月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4938的稳定细胞株表达，命名为Zaptuximab0
5.一株稳定表达抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的稳定细胞系，其分类名称为稳定表达抗DR5人-鼠嵌合抗体CHO细胞株，于2011年6月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4938。
6.一种稳定表达权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体，其特征在于所述重组真核表达载体带有CAG强启动子和二氢叶酸还原酶筛选标记，来自鼠抗人DR5的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的编码序列、人IgGl重链恒定区和轻链恒定区K链的序列以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A序列被有效连接以高效表达所述的人_鼠嵌合抗体，优选地，所述重组真核表达载体的起始质粒为pCDNA3,优选地,所述鼠抗人DR5的单克隆抗体为AD5-10。
7.根据权利要求6所述的稳定表达权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体，其特征在于来自鼠抗人DR5的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的编码序列、人IgGl重链恒定区和轻链恒定区K链的序列以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的Furin/2A序列的连接起来的序列如SEQ ID NO 9所示。
8.一种制备如权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤 A)用如权利要求6或7所述的稳定表达权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体转染CHO-dhfr_细胞； B)利用氨甲蝶呤加压筛选获得稳定表达嵌合抗体的细胞株。
9.一种如权利要求8所述的方法获得的稳定细胞株。
10.一种组合物，其活性成分为如权利要求I到4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体与化疗药物组成，优选地，所述化疗药物是TRAIL或表柔比星。
11.如权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区 的人-鼠嵌合抗体、如权利要求6或7所述的稳定表达权利要求I至4任一项所述的抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体或根据权利要求10所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌或肺癌。
全文摘要
本发明提供抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体DR5的人-鼠嵌合抗体及其制法与用途。具体而言，本发明涉及一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体，其由鼠源抗体IgG的可变区和人源抗体IgG的恒定区构成。本发明还涉及稳定表达抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体胞外区的人-鼠嵌合抗体的稳定细胞系，稳定表达所述人-鼠嵌合抗体的重组真核表达载体，制备所述人-鼠嵌合抗体的方法，所述人-鼠嵌合抗体及其组合物的用途。本发明所述嵌合抗体对DR5胞外区具有良好亲和力，对肿瘤细胞具有特异性的诱导细胞凋亡活性，可单独或与其它药物联用，用于多种肿瘤和其它DR5相关疾病的治疗。
文档编号C12N15/79GK102898524SQ20111020950
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者邱宇鹤, 刘彦信, 史娟, 郑德先 申请人:中国医学科学院基础医学研究所