专利名称：一种辅助鉴定hiv的引物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定HIV的引物组合物及其应用。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体，自 1981 年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播。中国艾滋病的流行已有25年，截止 2010年10月底，中国已累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病患者37万余例，其中艾滋病病人已逾13万之多，仅死亡病例就已超过6.8万。在有效控制以往有偿献/输血传播之后，近年来，随着社会经济的发展及艾滋病防治工作的有效深入，艾滋病疫情又出现了一些新流行特点①艾滋病疫情仍持续上升，但上升幅度有所减缓；②性传播已成为主要传播途径， 男男同性性传播呈快速上升态势；③局部地区和特定人群疫情比较严重。艾滋病疫情出现的新特点进一步加大了艾滋病防控的困难。因此，及早发现HIV感染者并进行行为干预是艾滋病防治的需要。HIV的感染可通过检测HIV特异性抗体、抗原、核酸或病毒分离培养加以确立，常规使用的标准诊断项目是血清学抗体检测。传统HIV抗体检测包括筛查试验(初筛和复检)和确认试验两个部分，该项检测特异性强、准确度高，不足之处为人体感染HIV后抗体的出现比较滞后，一般需要2-12周，平均45天左右血液中才可检测到HIV抗体。从感染 HIV到机体产生抗体的这一段时间称之为窗口期。在窗口期虽检测不到HIV抗体，但体内已有HIV，同样具有传染性，传播的危险很大，特别是对血液安全构成很大威胁，因此，研制能够有效检出窗口期感染者的检测方法是控制艾滋病疫情的迫切需要。HIV-I具有高度的变异性，我国已经发现了 HIV-I的A、B、B"、C、D、F等亚型毒株， 以及 CRF01-AE、CRF02-AG、CRF07-BC、CRF08-BC、CRF15-01B 等基因重组型毒株，是 HIV-I 亚型最复杂的国家之一。因此，设计出保守的、适用于多种亚型毒株检测的HIV引物对是研制 HIV核酸诊断试剂的关键。
发明内容
本发明的目的是提供辅助鉴定HIV的引物组合物及其应用。本发明提供的引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、 序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物组合物的功能为如下 (a)或(b) :(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV) ； (b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)感染患者。所述引物组合物在制备试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b) (a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV) ； (b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒 (HIV)感染患者。本发明还保护试剂盒，包括所述引物组合物；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b) :(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV) ； (b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)感染患者。本发明还保护一种辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)的方法，包括如下步骤(1)以待测病毒的总RNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对进行RT-PCR，得到第一轮PCR扩增产物； (2)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4 所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；如果第二轮PCR扩增产物中具有^a3p的特异DNA片段，待测病毒为候选的人免疫缺陷病毒(HIV)；如果第二轮PCR 扩增产物中不具有的特异DNA片段，待测病毒为候选的非人免疫缺陷病毒(HIV)。所述待测病毒具体可为人免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV)、人乙型肝炎病毒(HBV)或人丙型肝炎病毒(HCV)。所述人免疫缺陷病毒具体可为HIV-1B’亚型毒株、HIV-I CRFOl-AE亚型毒株或 HIV-1B/C重组亚型毒株。本发明以中国主要艾滋病流行地区的HIV-I毒株的pol区基因序列为基础，采用 Vector NTI AdvanceTM10分析软件和方法对序列的保守区进行了扫描，在此基础上设计了一组引物，采用我国主要HIV-I流行毒株的血浆标本及其他病毒(HBV、HCV、HTLV)的标本， 对引物进行了特异性鉴定，确定引物组合物HIV-CN- I (含HIV-CN- I -UHIV-CN- I -2、 HIV-CN- I -3,HIV-CN- I -4)能有效检出我国主要的HIV-I流行毒株，而与HBV、HCV、HTLV 等无交叉反应，可用于HIV-I核酸诊断试剂的设计和开发。本发明对于HIV-I的检测鉴定， 以及HIV感染者的辅助诊断具有潜在的应用前景，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。
图1为HIV-I蛋白酶区保守区域扫描结果。图2为HIV-I逆转录酶区保守区域扫描结果。图3为部分样本第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图4为将图3的特异条带回收纯化后的琼脂糖凝胶电泳图。图5为引物组合HIV-CN- I的特异性鉴定电泳图；1 :HCV_5 ；2 :HCV_71 ；3 HCV-75 ；4 :HCV-76 ；5 :HCV_93 ；6 :HCV_7 ；7 :HCV_56 ；8 :HCV_70 ；9 :HTLV_25 ；10 :HTLV_26 ； 11 :HTLV-36 ；12 :HTLV_37 ；13 :HTLV_38 ；14 :HBV_2 ；15 :HBV_5 ；16 :HBV_6 ；17 =HBV-IO ；18 HBV-12 ο
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。HTLV代表人类T淋巴细胞白血病病毒，HBV代表人乙型肝炎病毒，HCV代表人丙型肝炎病毒。 实施例1、引物组合物的设计 利用Vector NTI Advance 10分析软件对来自HIV感染者的共计1582条蛋白酶区与逆转录酶区序列(序列构成如表1)进行保守区域进行扫描，观察不同亚型POl区基因的变异程度。扫描结果显示，POl区蛋白酶区基因保守性优于逆转录酶区。表lHIV-lpol区基因序列构成情况
感染途径业型(构成比％)合计BCCRFOl-AECRF07-BCCRF08-BC其他性接触74 (18. 5)10 (4. 2)312 (48. 1)78 (15. 7)33 (8.2)18 (4.9)525血液感染1006(77. 8)1 (2. 2)4(8. 9)1 (2. 2)1 (2. 2)3 (6. 7)1016其他12(29. 3)2 (4. 9)16(39. 0)4(9. 8)2 (4. 9)5(12. 2)41合计1092133328336261582蛋白酶区的保守区域扫描结果见图1。逆转录酶区的保守区域扫描结果见图2。基于序列分析结果设计一组引物(命名为引物组合物HIV-CN- I )，由引物 HIV-CN- I -1、引物 HIV-CN- I -2、引物 HIV-CN- I -3 和 HIV-CN- I _4 组成。各条引物的序列和针对基因的位置见表2。表2各条引物的序列和针对基因的位置
引物名称序列(5，一 3，)位置HIV-CN- I -1(上游引物；序列表的序列1)CTCTTTGGCAACGACCCCT2263 — 2281HIV-CN- I -2(下游引物；序列表的序列2)AACCCTGCTGGATGTGGTATTC2848 — 2827HIV-CN- I -3(上游引物；序列表的序列3)GATACAGGAGCAGATGATACA2325 — 2345HIV-CN- I -4(下游引物；序列表的序列4)GCTTTAATTTTACTGGTACA2589 — 2570实施例2、引物组合物的敏感性一、实验样本将临床确诊的41位HIV感染者(知情同意的志愿者)的血浆标本作为实验样本， 其中17例为感染HIV-I B’亚型毒株的患者、12例为感染HIV-I CRFOl-AE亚型毒株的患者、12例为感染HIV-I B/C重组亚型毒株的患者。二、引物组合物的应用分别将步骤一的各个患者的血浆进行如下实验1、提取总 RNA。2、以步骤1的总RNA为模板，用HIV-CN- I _1和HIV-CN- I _2组成的引物对进行RT-PCR (第一轮PCR扩增)，得到第一轮PCR扩增产物。第一轮PCR扩增的反应体系见表3。表3第一轮PCR扩增的反应体系
权利要求
1.一种引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物组合物的功能为如下(a)或(b)(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒；(b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒感染患者。
2.权利要求1所述引物组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a) 或(b)(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒；(b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒感染患者。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组合物；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒；(b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒感染患者。
4.一种辅助鉴定人免疫缺陷病毒的方法，包括如下步骤(1)以待测病毒的总RNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示 DNA组成的引物对进行RT-PCR，得到第一轮PCR扩增产物；(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示 DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；如果第二轮PCR扩增产物中具有 5bp的特异DNA片段，待测病毒为候选的人免疫缺陷病毒；如果第二轮PCR扩增产物中不具有^^bp的特异DNA片段，待测病毒为候选的非人免疫缺陷病毒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述待测病毒为人免疫缺陷病毒、人类T淋巴细胞白血病病毒、人乙型肝炎病毒或人丙型肝炎病毒。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定HIV的引物组合物及其应用。本发明提供的引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物组合物的功能为如下(a)或(b)(a)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)；(b)辅助鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)感染患者。本发明对于HIV的鉴定，以及HIV感染者的辅助诊断具有重要应用价值，对于社会健康具有重大影响。
文档编号C12N15/11GK102250891SQ20111021048
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者刘思扬, 刘永健, 庄道民, 李天一, 李敬云, 李林, 李韩平, 王晓林, 郭伟, 鲍作义 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所