专利名称：一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法
技术领域：
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法。
背景技术：
传统化石资源的大量开采和使用，带来温室效应、气候恶化的同时，化石资源匮乏引发的能源危机也日益突出。为了缓解目前的能源危机和环境问题，生物柴油作为化石能源的替代品已经成为国际上的热点。陆生高等植物油脂、废餐饮油以及动物油脂都可以作为制备生物柴油的原料，但它们的供应量是非常有限的，就算把它们加起来也难以满足人类对燃油的需求。异养微藻能在有限的土地上全年连续高密度生长，并可在一定条件下将 无机碳和有机碳转化为藻体内大量贮存的油脂，而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。虽然产脂微藻是目前最好的生物柴油工业生产来源，但它的含油量不高，导致大规模培养微藻生产油脂成本昂贵，最终使得利用微藻制备生物柴油难以获得经济效益，产业化进程减缓。提高微藻细胞的油脂含量是目前降低成本的关键，有望从根本上解决生物柴油产业成本过高的瓶颈问题。因此，一直需要努力不懈的研究，以开发出产脂量及生物量更高的优良藻株，为单细胞油脂及生物柴油的工业生产提供具有竞争力的原材料。为了提高微藻细胞的产脂量，过去的研究主要集中在以下几个方面(I)培养基优化；(2)培养过程控制；(3)代谢工程方法改造藻株；(4)诱变选育高脂突变株。前两种方法虽然可在一定程度上有效促进藻细胞的产脂量，但提高的百分比数有限(通常提高20%以下)，仍无法满足产业化规模开发的要求。代谢工程方法改造微藻是解决藻细胞脂含量低的根本方法，需要全面考虑藻株的整体代谢网络的结构和调控特点，有待进一步进行研究，研发成本较高。诱变育种方法研发成本低，选育周期短，是提高微藻细胞产脂量的有效途径。诱变育种方法的探索过程中，国内外科技工作者们发明了多种诱变手段(如物理诱变、化学诱变、物理化学复合诱变、多轮诱变等等)，以及多种高通量快筛高脂突变株的方法(如尼罗红染色法、磷酸香草醛法、称重法等等)，但也存在一些不足之处，如高脂突变株的筛选是盲目的、非定向的，往往是高脂突变株、低脂突变株、变化不显著的突变株藻落同时出现，无法区分，检测后才能根据结果进行确认，不可避免的造成人力、物力、财力的浪费，并增大工作量。理论上讲，从诱变处理后的藻株中，选育耐受脂合成抑制剂的微藻突变株可作为一种有效的手段，实现高脂突变株的定向筛选，避免盲目性，再结合以高通量的产脂量确认方法进一步验证，无疑将会以最节约的成本、最快的时间和最小的工作量选育出产脂量增强显著、可稳定遗传的微藻新品系。
发明内容
本发明目的在于提供一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种异养微藻的高脂突变株定向选育方法I)将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的小球藻，或其它具有暗异养生长特性的产脂微藻株系，采用EMS化学诱变处理；将具有暗异养生长特性的产脂微藻株系(小球藻)，接种到Kuhl培养基中，在温度为18-35°C，转速为100-200rpm，光照强度为20-150 μ mol m_2 s—1连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期，在培养至对数生长期的每毫升藻体内加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗条件下以18-35°C处理15_180min，而后加入EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应；所述Kuhl培养基为10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、(λ 012mg/L四水钥酸铵，pH 6. 5。 2)将步骤I)诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养；即将诱变处理后藻体洗涤后观测其细胞浓度，根据细胞数将藻体稀释IO3-IO6倍，分别涂布到高脂定向筛选平板上，置于18-35°c的程控恒温培养箱中无光静置培养，筛选单细胞体积增大的藻体于Kuhl培养基中,在温度为18-35°C,转速为100-200rpm,光照强度为20-150 μ mol m_2 s—1连续光照的摇床中振荡扩种继代培养至对数生长期。3)将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进行诱导培养6-20天，待用；具体为将扩种继代培养至对数生长期的藻体中加入50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至总体积500ml)至终浓度为30-60g/L，诱导培养6_20天，使藻细胞内脂的大量合成，而后用去离子水3000g低温离心洗涤，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。4)取步骤3)藻体利用气相色谱(GC)测定突变株与野生株的脂含量，突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值大于110%，即突变株为单细胞油脂高脂突变株；将诱导培养后藻体中加入甲苯、1%硫酸一甲醇(体积比为硫酸甲醇=I 99)和十九烷酸(C19:0)内标液混合均匀后，置于50-60°C振荡水浴过夜；取出，冷却后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均匀后，离心收集上层液体，向收集的上层液中加入2% KHCO3水溶液混合均匀，漩涡仪上混匀离心收集上层液体，用氮气吹干溶剂后，用正己烷定容，利用气相色谱(GC)测定突变株中脂含量。所述气相色谱条件为采用分流模式，以氮气为载气；进样口温度为250°C ;FID检测器温度为260°C ;柱温箱的温度为以2. 5°C /min的升温速率从140°C升至240°C。本发明所具有的优点现有的微藻高脂突变株的筛选技术多是将诱变处理后的藻株涂布在生长平板上培养，筛选过程是非定向的，往往是高脂突变株、低脂突变株、变化不显著的突变株藻落同时出现在生长平板上，无法用肉眼区分，检测后才能根据结果进行确认，基本属于盲筛，不可避免的造成人力、物力、财力的浪费，并增大工作量。本发明在无光异养条件下，采用高脂定向筛选平板(含脂合成抑制剂)培养诱变处理后的藻株，既保证了耐受脂合成抑制剂的突变株藻细胞在平板上存活并生长良好，又避免了脂合成抑制剂光解而失去高脂定向筛选的效果。因而可以直接用肉眼筛选出平板上长出的高脂突变株，避免低脂突变株和脂含量变化不显著的突变株的干扰，实现了高脂突变株的定向筛选，因此大大提高了选育效率，减少了无用工作量，节约了研发成本和研发时间。
具体实施例方式以下结合实施例为本发明作进一步描述。第一步、在无菌操作台上，挑取固体培养基上生长状态良好的原始小球藻(Chlorella kessleri)藻落，接种到含IOml无菌Kuhl培养基的50ml三角瓶中，在温度为25°C,转速为150rpm,光照强度为ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4连续光照的摇床中振荡培养。Kuhl培养基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、
O.012mg/L四水钥酸铵，加水至总体积1000ml, pH 6. 5。
第二步、取第一步中生长至指数期的藻液，进行EMS化学诱变处理。在黑暗无菌条件下，取3ml藻液到有盖的无菌玻璃试管中，加入300μ I EMS溶液(IM)，充分混匀。25°C处理30min，以处理Omin作为空白对照。加入EMS溶液等体积无菌现配的硫代硫酸钠溶液(10%, w/v)终止诱变反应。第三步、将第二步中诱变处理完毕的藻细胞分别用新鲜无菌Kuhl培养基离心(3000rpm, IOmin)清洗两次，收集沉淀将其悬浮在3ml新鲜无菌Kuhl培养基中，4°C避光存放。第四步、观测第三步中悬浮液的细胞浓度，而后将第三步中悬浮液稀释至空白对照组细胞密度，空白对照组细胞密度约为lX103cellS/ml，取100μ I稀释的藻液涂布高脂定向筛选平板，将涂布了藻液的500个平板置于25°C的程控恒温培养箱中无光静置培养。所述配制的高脂定向筛选平板为，配制含有15g/L琼脂的高起始C/N比(30g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾)的Kuhl培养基，于120°C下高压蒸汽灭菌20分钟后冷却至50°C，加入过滤灭菌后的脂合成抑制剂浅蓝菌素(Cerulenin)至终浓度为200 μ M，轻轻摇动混匀，倒制成高脂定向筛选平板。第五步、将能够在第四步中生长的菌株与对照(原始小球藻)相比单克隆藻明显增大的单克隆藻落挑出，悬浮到装有3ml新鲜无菌Kuhl液体培养基的玻璃试管中，在温度为25°C,转速为150rpm,光照强度为ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 S4连续光照的摇床中振荡培养,进行扩种继代培养；第六步、将第五步中生长至指数期的藻液中加入已灭菌的50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至总体积500ml)至终浓度为50g/L，诱导藻细胞内脂的大量合成。第七步、在第六步中诱导培养6天时,取50ml藻液,用去离子水3000rpm低温离心洗涤2次，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。第八步、称取第七步中所述干藻粉20mg，加入Iml甲苯、2ml I %硫酸一甲醇(体积比为硫酸甲醇=1 99)、0.8ml十九烷酸(C19:0)内标液，漩涡仪上混匀后，置于50°C振荡水浴过夜。取出，冷却后，加入5ml 5% NaCl水溶液、3ml正己烷，漩涡仪上混匀，离心收集上层液体，重复多次直至提取完全，向收集的上层液中加入6ml 2% KHCO3水溶液，漩涡仪上混匀，离心收集上层液体，用氮吹仪吹干溶剂后，用正己烷定容至lml，去除杂质后转移入色谱进样瓶中，4°C保存。将样品中的有效脂肪酸提取并甲酯化以便利用气相色谱(GC)测定。利用气相色谱(GC)法测定第八步所述提取液。色谱条件为DB_23毛细管气相色谱柱(30mX0. 25mmX0. 25 μ m);氮气为载气；采用分流模式，进样体积为I μ I ;进样口温度为250°C ；FID检测器温度为260°C ;柱温箱的温度为以2. 5°C /min的升温速率从140°C升至240°C。通过比较脂肪酸甲酯与可信标准的停留时间来识别脂肪酸甲酯，并且通过比较脂肪酸甲酯与内标的峰面积对脂肪酸甲酯进行量化(参见表I)。本实施例以小球藻(Chlorella kessleri)为原始株,经化学诱变剂EMS处理,高脂定向筛选平板初筛，获得80个高脂突变株新品系，经气相色谱法复筛，分析结果显示，这80个新品系确实全部为高脂突变株，其中突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值为110-150%的占 9%，为 150-200%的占 43%，200% 以上的占 48%。其中的一个新品系小球藻(Chlorella kessleri)Al,其目的产物脂的产脂率高达野生株的2. 14倍，而生长状况与出发株一致，是一个理想的优良突变株，可应用于单细胞油脂及生物柴油的工业生产有一定的优势。该高脂突变株新品系于2011年5月27日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCC No. 4917,该藻株命名为小球藻(Chlorella kessleri) Al CGMCC No. 4917。小球藻(Chlorellakessleri)Al CGMCC No. 4917藻株的脂肪酸组成、各脂肪酸占总脂肪酸的比例、以及产脂率如下表I :表I突变株Al诱导脂合成六天时脂肪酸组成及含量与野生株的比较。
权利要求
1.一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于 1)将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的具有暗异养生长特性的产脂微藻株系，采用EMS化学诱变处理； 2)将步骤I)诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养； 3)将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进行诱导培养6-20天，待用； 4)取步骤3)藻体利用气相色谱(GC)测定其脂含量以及野生株的脂含量，突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值大于110%，即突变株为单细胞油脂高脂突变株；其高脂突变株已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为 CGMCC No. 4917。
2.按权利要求I所述的异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于将具有暗异养生长特性的产脂微藻株接种到Kuhl培养基中，在温度为18-35°C，转速为100-200rpm，光照强度为20-150 μ mol m_2 s—1连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期，在培养至对数生长期的每毫升藻体内加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗条件下以18-35°C处理15-180min,而后加入EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应； 所述Kuhl培养基为10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、O. 012mg/L四水钥酸铵，pH 6. 5。
3.按权利要求I所述的异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于将诱变处理后藻体洗涤后涂布到高脂定向筛选平板上，置于18_35°C的恒温培养箱中无光静置培养，筛选单细胞体积增大的藻体于Kuhl培养基中，在温度为18-35°C，转速为100-200rpm，光照强度为20-150 μ mol m_2 s—1连续光照的摇床中振荡扩种继代培养至对数生长期。
4.按权利要求I所述的异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于将扩种继代培养至对数生长期的藻体中加入50%葡萄糖母液至终浓度为30-60g/L，诱导培养6-20天，使藻细胞内脂的大量合成，而后用去离子水3000g低温离心洗涤，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。
5.按权利要求I所述的异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于将诱导培养后藻体中加入甲苯、1%硫酸一甲醇和十九烷酸(C19:0)内标液混合均匀后，置于50-60°C振荡水浴过夜；取出，冷却后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均匀后，离心收集上层液体，向收集的上层液中加入2% KHCOyK溶液混合均匀，漩涡仪上混匀离心收集上层液体，用氮气吹干溶剂后，用正己烷定容，利用气相色谱(GC)测定突变株中脂含量。
6.按权利要求I所述的异养微藻的高脂突变株定向选育方法，其特征在于所述气相色谱条件为采用分流模式，以氮气为载气；进样口温度为250°C ；FID检测器温度为260°C ；柱温箱的温度为以2. 50C /min的升温速率从140°C升至240°C。
全文摘要
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法。将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的具有暗异养生长特性的产脂微藻株系，采用EMS化学诱变处理；将诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养；将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进行诱导培养6-20天，取上述藻体利用气相色谱测定突变株与野生株的脂含量，突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值大于110％，即突变株为单细胞油脂高脂突变株。
文档编号C12R1/89GK102888393SQ20111021846
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者王艳, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所