专利名称：一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因重组表达技术，具体涉及一种通过高效准确的连接反应直接构建线性化载体片段实现线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段。
背景技术：
基因重组表达技术在当今的生物科学研究及产业化中有着越来越广泛的应用。目前，基因重组表达的宿主生物有很多种，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。很多情况下，在利用这些宿主生物表达目的基因时需要先在大肠杆菌中构建一个正确插入目的基因的环状质粒载体，将该载体提纯、线性化后再转化宿主生物，目的基因通过同源重组整合到宿主生物的基因组中，根据筛选基因可获得稳定表达的克隆子。比如常用 毕式酵母(Pichia pastoris)的pPIC9K载体(Invitrogen)和中国仓鼠卵巢细胞CHO的pOptiVECtm-TOPO 载体(Invitrogen)都属此类。图 2 以毕式酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115和载体pPIC9K表达绿色荧光蛋白GFP为例说明该重组表达过程的基本步骤。从图中可知该重组表达过程基本上由17步操作完成，其中有15步操作是在构建一个线性化载体片段，期间需要多次细菌培养、质粒抽提、酶切、纯化等操作，成本较高且繁琐，一般需要一周以上的时间。如果能够将可规模制备的、通用的类似载体的并含有基因表达所需元件的DNA片段与目的基因片段通过连接反应直接制备图2中第15步所需的线性化载体片段或者有相同功能的DNA片段，则可以避开质粒载体构建过程，相关工作一天内可以完成而且非常简单，这必将大大加快重组表达的速度，技术路线见图3。上述直接构建线性化载体的过程对连接反应效率要求很高。当前基因的克隆表达中广泛应用的连接反应的类型有以下三种一、在极大多数的环状的克隆表达质粒载体中均含有多克隆位点，目的基因和载体经多克隆位点中的限制性内切酶酶切后产生末端，末端间可以通过连接酶催化连接反应；二、在T载体和TOPO系列载体(Invitrogen)中，载体和目的基因通过末端的碱基T和A产生连接反应，其中在T载体中反应由连接酶催化，而在TOPO系列载体中反应由拓扑异构酶I (Topoisomerase I)介导连接反应；三、其它非连接酶催化的连接反应，如GatewayTM系统(Gibco/Life Technologies)和EchoTM系统(Invitrogen)采用Cre酶介导的LoxP位点同源重组构建载体。实践中发现上述三大类连接反应连接效率均非常低而且极易产生错误连接，需要在大肠杆菌中筛选正确连入目的基因的阳性克隆子，显然不适合直接用于构建线性化载体。中国专利申请案(中国专利申请号02116936. 5、02117763· 5和02123460. 4)报道
了三种无需克隆的线性化载体构建方法并且注重参与连接反应的末端的产生。每个发明中分别给出一种末端产生的方法，分别是以非对称性切割的限制性内切酶酶切产生末端、DNA和RNA杂交体的RNA突出末端作为末端、切口酶及核酸外切酶作用产生末端。带有相应末端的相当于载体的片段和目的基因由T4DNA连接酶催化产生连接反应从而构建无需克隆的线性化载体。实际应用中这些方法受到一定的限制，未能进一步得到推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种通过高效准确的连接反应直接构建线性化载体片段实现快速转基因的方法。本发明主要是通过如图I所示的三段DNA片段的高效准确的连接反应直接构建转化表达目的基因的宿主生物所需的线性化载体片段或者有相同功能的片段，避开了通过构建环状质粒载体得到线性化载体片段的繁琐方法，从而实现快速转基因的操作。为方便表述，在本发明中对图I中三段依次连接的DNA片段称为前类载体片段、目的基因片段和后类载体片段。目的基因片段中，编码链5’端对应的DNA序列的一端称为目的基因片段的前端，编码链3’端对应的DNA序列的一端称为目的基因片段的后端。目的基因片段的前端与前类载体片段后端连接，目的基因片段的后端与后类载体片段前端连接。
本发明一方面提供了一种线性化表达载体构建方法，包括下列步骤I)设计前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段，所述前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段满足下列要求；所述目的基因片段含有目的基因且两个末端均为5’冗余粘性末端；所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同时满足下列要求a)单个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为1-10个，较佳的为2_6个，最佳的为2-4 个；b)两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任一冗余碱基均与目的基因片段中任一单链DNA的3’端首个碱基的互补碱基不同，冗余末端由T4DNA聚合酶降解产生；进一步优选的，所述目的基因片段的5’冗余粘性末端还满足下列要求中至少一项c)两个5’冗余粘性末端中至多只有一个5’冗余粘性末端含有回文对称序列；较佳的是两个5’冗余粘性末端均没有回文对称序列。d)两个5’冗余粘性末端之间碱基的匹配率要低。较佳的，两个5’冗余粘性末端之间最多的连续配对的碱基个数不大于任一个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数的一半，且当出现多个间隔的连续配对时，匹配的碱基总个数小于不匹配的碱基总个数。连续配对是指一个冗余末端中2个或者2个以上紧邻的碱基同时与另一冗余末端中相应的碱基配对。所述前类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链5’端对应的5’冗余粘性末端(目的基因片段的前端)相互补，该末端即为前类载体片段的后端，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端，该末端即为前类载体片段的前端；所述后类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端(目的基因片段的后端)相互补，该末端即为后类载体片段的前端，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端，该末端即为后类载体片段的后端；2)按照步骤I)的设计构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；
3)将步骤2)构建的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段直接采用连接酶连接获得前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体。步骤I)中，所述5’冗余粘性末端是指带5’突出的粘性末端；所述冗余碱基是指5’冗余粘性末端中5’突出部分的单链碱基。所述目的基因两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任一冗余碱基均与目的基因片段中任一单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同。举例来说，如下列片段即符合上述规定 (1)5，AAATG§A------------TG3，
II
3，GT------------A§TTT 5，
(2)5’ TTTTG§A------------TT3’
II
3，GT------------A0GTG 5，上述片段中，下划线部分为冗余碱基，带方框的碱基即为单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基。在片段(I)中，冗余碱基种类为A、T和G，两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基均为C，任一冗余碱基均与两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同；在片段(2)中，冗余碱基种类为T和G，两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基分别为C和A，任一冗余碱基均与两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同。设计出符合步骤I)要求的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段后，可将前类载体片段和后类载体片段构建于质粒载体以制备含有所需末端的类载体片段，可将目的基因的PCR扩增产物用T4 DNA聚合酶酶处理以制备含有所需末端的目的基因片段。所述步骤3)中，连接酶可选自T4 DNA连接酶或大肠杆菌连接酶。本发明中，三段DNA依次经连接酶连接产生“前类载体-目的基因-后类载体”的线性化载体片段(即前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体)的连接反应中，只有前类载体片段的后端与目的基因片段的前端的连接反应，以及后类载体片段的前端与目的基因片段的后端的连接反应是预期的，而其他末端之间的连接反应均是非预期的。为确保前类载体片段的前端或后类载体片段的后端尽可能地不参与任何连接反应，最优化的方式是前类载体片段的前端或后类载体片段的后端均为平末端，选用大肠杆菌连接酶。平末端的产生可采用酶切后为平末端的限制性内切酶，也可对酶切后的粘性末端经单链核酸外切酶削平处理获得平末端或者经DNA聚合酶补平处理获得平末端。较佳的，目的基因片段的构建包括下列步骤A.设计引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物；B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端。
步骤A中所述引物包括一上游引物与下游向引物，所述上游引物与下游引物的5’端均加入1-10个碱基的多核苷酸接头序列以与所设计的5’冗余粘性末端的冗余碱基段相对应。上述步骤B中，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端的方法为将纯化的目的基因的PCR扩增产物在有碱基底物存在的反应体系中，用T4 DNA聚合酶处理，最终获得带有5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述碱基底物选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必须含有待构建目的基因的两条单链DNA 3’端的首个喊基相对应的喊基底物,而不得含有待构建的目的基因片段中任一冗余碱基的互补碱基相对应的碱基底物。所述碱基底物并且必须含有待构建目的基因的两条单链DNA 3’端的首个碱基相对应的喊基底物，而不得含有待构建的目的基因片段中任一几余喊基的互补喊基相对应的碱基底物。举例来说，如果拟构建的目的基因片段如下
权利要求
1.一种线性化表达载体构建方法，包括下列步骤 1)设计前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段， 所述前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段满足下列要求； 所述目的基因片段含有目的基因且两个末端均为5’冗余粘性末端； 所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同时满足下列要求 a)单个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为1-10个； b)两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任一冗余碱基均与目的基因片段中任一单链DNA的3’端首个碱基的互补碱基不同，冗余末端由T4 DNA聚合酶降解产生； 所述前类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链5’端对应的5’冗余粘性末端相互补，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端； 所述后类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端相互补，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端； 2)按照步骤I)的设计构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段； 3)将步骤2)构建的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体。
2.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述目的基因片段的5’冗余粘性末端还满足下列要求中至少一项 c)两个5’冗余粘性末端中至多只有一个5’冗余粘性末端含有回文对称序列； d)两个5’冗余粘性末端之间碱基的匹配率要低。
3.如权利要求2所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述要求c)为两个5’冗余粘性末端均没有回文对称序列；所述要求d)具体为两个5’冗余粘性末端之间最多的连续配对的碱基个数不大于任一个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数的一半，且当出现多个间隔的连续配对时，匹配的碱基总个数小于不匹配的碱基总个数。
4.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，要求a)为单个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为2-4个；
5.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤3)中，连接酶选自T4 DNA连接酶或大肠杆菌连接酶。
6.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，步骤2)中，目的基因片段的构建包括下列步骤 A.设计引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物； B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端。
7.如权利要求6所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤B中，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端的方法为将纯化的目的基因的PCR扩增产物在有碱基底物存在的反应体系中，用T4 DNA聚合酶处理，最终获得带有5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述碱基底物选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必须含有待构建目的基因片段的两条单链DNA 3’端的首个碱基相对应的碱基底物，而不得含有待构建的目的基因片段中任一冗余碱基的互补碱基相对应的碱基底物。
8.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述前类载体片段和后类载体片段的制备方法为在设计的类载体片段的4个末端加上多核苷酸接头，制备带有多核苷酸接头的类载体片段后，将其克隆在环状质粒载体中或者改造现有的一些质粒载体，而后将所述质粒载体在大肠杆菌中复制，提取质粒，通过工具酶处理多核苷酸接头获得符合步骤I)所述要求的末端。
9.如权利要求8所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述用工具酶处理多核苷酸接头获得符合步骤I)所述要求的末端，选用以下方法之一 方法一利用限制性内切酶酶切类载体片段末端的多核苷酸接头，直接获得末端恰好符合步骤I)末端设计要求的前类载体片段和后类载体片段； 方法二 先利用限制性内切酶酶切类载体片段末端的多核苷酸接头，再用核酸酶、DNA聚合酶处理限制性内切酶产生的末端以产生符合步骤I)末端设计要求的冗余末端。
10.如权利要求I所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体中，含有同源重组序列、筛选基因、启动子和终止子。
11.如权利要求10所述线性化表达载体构建方法，其特征在于，所述前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体中还含有增强子、信号肽和与目的基因产物融合的蛋白中的至少一种。
12.一种用于构建线性化表达载体的类载体片段，包括前类载体片段和后类载体片段，所述前类载体片度的后端为5’冗余粘性末端，前端为平端；后类载体片段的前端为5’冗余粘性末端，后端为平端；所述前类载体片度和后类载体片段的5’冗余粘性末端同时满足下列要求 A.前类载体片段的后端的5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为2个，后类载体片段的前端的5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为3个； B.所述两个5’冗余粘性末端无回文对称序列； C.所述两个5’冗余粘性末端自身及之间连续配对的碱基个数小于2个。
13.如权利要求12所述用于构建线性化表达载体的类载体片段，其特征在于，所述前类载体片段和后类载体片段含有同源重组序列、筛选基因、启动子和终止子。
14.如权利要求12所述用于构建线性化表达载体的类载体片段，其特征在于，所述前类载体片段的后端5’冗余粘性末端的冗余碱基序列为3’-GA 5’，另一末端为平端；后类载体片段的前端5’冗余粘性末端的冗余碱基序列为5’ GAC-3’，另一末端为平端。
15.如权利要求14所述用于构建线性化表达载体的类载体片段，其特征在于，所述前类载体片段包含在序列为SEQ ID NO: I的片段中，两端经SnaB I和Acc I酶切即产生所述末端，所述后类载体片段包含在序列为SEQ ID NO :2的片段中，两端经SnaB I和Cpo I酶切即产生所述末端。
16.如权利要求12或13所述类载体片段的使用方法，包括下列步骤 I)目的基因片段的构建 A.设计带有多核苷酸接头的PCR引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物；设计的多核苷酸接头应满足使得PCR扩增产物经T4DNA聚合酶处理后两端均产生5’冗余粘性末端，且编码链5’端对应的5’冗余粘性末端与所述类载体片段的前类载体片段的后端5’冗余粘性末端互补，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端与所述类载体片段的后类载体片段的前端5’冗余粘性末端互补； B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶处理或工具酶酶切产生5’冗余粘性末端； 2)将目的基因片段与所述类载体片段连接。
17.如权利要求16所述的使用方法，其特征在于，步骤I)所述带有多核苷酸接头的PCR引物中，目的基因的上游引物带有5’CTA-3’接头，目的基因的下游引物带有3’-ACTG5’接头，采用所述PCR引物扩增后的扩增产物，在碱基底物dTTP存在下，经T4 DNA聚合酶在处理后产生5’冗余粘性末端；步骤2)所述类载体片段为权利要求14或15所述类载体片段。
全文摘要
本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102911961SQ20111021838
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者尚玉栓 申请人:尚玉栓