专利名称：利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法
技术领域：
本发明涉及工业化生产花生四烯酸的方法，具体涉及在特定的工艺条件下，利用高山被孢霉扩配生产花生四烯酸油脂的工业方法。
背景技术：
花生四烯酸(Arachidonic Acid,简称ARA)是n_6系列多不饱和脂肪酸,它作为合成人体前列腺素、凝血嗯烷以及白三烯的前体物质，具有广泛的生物活性。花生四烯酸还具有重要的营养作用，作为人母乳的天然成分，对婴儿的神经及生理的发育必不可少，已经被多个专家组织包括世界卫生组织推荐作为营养补充剂添加到婴儿配方奶粉中。花生四烯酸主要来源于动物肝脏、鱼油、牛肾上腺等，但动物组织中花生四烯酸的质量百分浓度很低，仅为O. 2%，且来源非常有限。利用微生物发酵法生产花生四烯酸作为一种生产花生四烯酸的新途径，具有不受原材料和气候限制、生产周期短、工艺简单、成本较低、产物含量高、分离提取容易等优点，引起了国内外研究人员的广泛关注。
YASUHISA等研究发现C/N比会影响菌丝的形态，当C/N比小于20时，菌丝球的大小和宽度不变；C/N比大于20时，菌丝球的大小和宽度会随着C/N比的增加而变大；C/N比在15 20时,花生四烯酸的产量最高。Higashiyama等研究了无机盐对高山被孢霉菌丝形态和ARA产量的影响，结果显示在含有大豆粉和葡萄糖的培养基中，加入KH2PO4, Na2SO4, CaCl2和MgCl2的情况下，经优化，ARA产量可达到9. 8g/L。由于花生四烯酸存在于菌体脂质中，增加菌体中类脂成分是增加花生四烯酸产量的首要条件。A. Singh等研究发现添加黄豆粉和植物油可以显著提高M. Alpina ATCC 3222发酵的菌体重量、油脂含量和花生四烯酸产量，ARA产量最高可达11. lg/L。周蓬蓬等发现毛霉菌油对高山被孢霉的生长和油脂产量基本没有影响，但是能提高ARA在油脂中的含量，因而可以提高ARA产量。发明内容
本发明提供了一种利用高山被孢霉生产花生四烯酸的工业方法，该方法通过特定的工艺控制可使花生四烯酸的单位产量达到IOg ARA/L发酵液。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为
利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，它包括以下步骤
(I)原始菌株的活化将高山被孢霉菌株斜面培养，获得高山被孢霉的孢子悬液；
(2)种子培养将高山被孢霉的孢子悬液接种于摇瓶培养基中振摇培养获得种子培养液；
(3)种子扩大培养根据最终发酵罐的大小，将步骤(2)的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液；
(4)发酵培养，包括初始发酵阶段和后发酵阶段
初始发酵阶段
将步骤(3)的种子扩大培养液接种于发酵罐中进行搅拌培养，所述发酵培养基的主要原料组分按质量百分比计为葡萄糖4 6%、酵母粉I 3%、市政自来水，pH值5 7， 在该初始发酵过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，并在发酵初始的16h 内根据泡沫产生情况加入食用油，食用油的加入量按体积百分数计为发酵液体积的O. I O. 3% ；
当发酵液菌浓达到40% (体积比)，干菌体总油达到40被％时，初始发酵过程结束，进入后发酵阶段；
后发酵阶段
将上述发酵液降温至25±2°C，同时加入无菌氨水，调节pH值为8 9，静置发酵， 在发酵过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖含量在I. O I. 5wt %，并在花生四烯酸含量高于40wt%后停止补加葡萄糖；当发酵液中花生四烯酸的含量高于45被％时，后发酵阶段结束；
(5)将发酵液经发酵后处理得到含有花生四烯酸的油脂。
按上述方案，所述的步骤(I)为将高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在 28± 1°C下培养8 10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬液。
按上述方案，所述的步骤(2)为将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28土1°C下振摇培养48h，摇床振摇转速为200±20转/分钟，培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖4 6%、蛋白胨I 2%、酵母浸膏2 4%、基质蒸馏水，pH值为7±0. 2。
按上述方案，所述步骤(3)的种子培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖 5 10 %、酵母粉I 3 %、食用油O. I O. 3 %、市政自来水，自然pH值，并在菌浓达到20 % (体积比)时进行下一步扩大培养。
按上述方案，所述步骤(3)中的每级培养时间为24 32h，培养温度为30±2°C， 空气流量为O. 8 I. OmVm3发酵液/min，罐内压力在O. 15 O. 2MPa ;所述搅拌培养的搅拌速度优选为50 70转/min。
按上述方案，所述步骤(4)中的初始发酵温度控制为30±2°C、pH值自然变化、空气流量为O. 8 I. OmVm3发酵液/min，罐内压力在O. 2 O. 3MPa。
按上述方案，所述步骤(4)中流加的葡萄糖为10 30wt%的无菌葡萄糖溶液。
按上述方案，所述步骤(4)中初始发酵阶段的搅拌速度为50 70转/min。
按上述方案，所述步骤(4)中后发酵阶段的空气流量为I. O I. 5m3/m3发酵液/ min，罐内压力在O. 2 O. 3MPa。
按上述方案，所述的步骤(5)为将发酵液依次经灭活、菌液分离、干燥、微生物油脂提取处理。
本发明的有益效果
(I)本发明方法仅使用酵母粉和葡萄糖作为主发酵原料，简化了发酵配方，可以对发酵原材料进行有效的控制；
(2)通过调控工艺，能提高发酵产能，使每升发酵液的ARA产量达到10g/L。具体调控的工艺步骤有将发酵步骤分为初始发酵阶段和后发酵阶段，并针对不同的阶段采用不同的控制工艺，在种子扩大培养和初始发酵阶段采用搅拌培养，利于霉菌细胞前期细胞数的积累，同时在初始发酵阶段添加植物油，一方面可用于发酵前期生物泡沫的控制，另一方面也可作为微生物油脂的合成前体和碳源的供应；在后发酵阶段停止搅拌，静置发酵，有利于霉菌油脂及ARA含量的积累；后发酵阶段使用的氨水即是pH调节剂，也是氮源补充剂； 在发酵过程中通过控制发酵液中葡萄糖的含量可促进油脂的积累及花生四烯酸转化的能力；采用高罐压进行发酵培养，有利于提高溶氧水平，从而提高发酵水平；
(3)工艺简便，易于控制，实现工业化生产。
具体实施方式
实施例I :
I原始菌株的活化将使用安倍管保存的高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28 ± I °C下培养8天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水制成孢子悬液；
2种子培养将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28± 1°C下振摇培养48h,摇床振摇转速为200±20转/分钟，液体培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖4%、蛋白胨I %、酵母浸膏3%、基质蒸馏水，pH值为7. 2 ；
3种子扩大培养最终发酵罐体积为50m3，因此选取种子罐分别为10m3、Im3Jf 1.5L步骤(2)的摇瓶种子发酵液接种到Im3的种子扩大发酵罐中，种子培养基中主要原料组分的质量百分比分别为葡萄糖6%、酵母粉I. 3%、食用油O. 15%、市政自来水，自然 pH值，空气量根据需要控制在O. 8 I. 0m3/m3发酵液/min，罐内压力控制在O. 17MPa，在 30±2°C培养24h，发酵罐中发酵液的菌浓为25% (体积比)，将该种子发酵液接种入IOm3 的种子扩大发酵罐进行第二次扩大培养，该种子扩大发酵罐中种子培养基主要原料组分的质量百分比为葡萄糖5 %、酵母粉2 %、食用油O. 2 %、市政自来水，自然pH值，空气量根据需要控制在O. 8 I. OmVm3发酵液/min，罐内压力控制在O. 19MPa，搅拌速度控制为55转 /min，发酵培养28h后，发酵罐中发酵液的菌浓为30% ；
(4)将步骤(3)的第二次种子扩大培养液接种到50m3的发酵罐中进行初始发酵， 该发酵罐中发酵培养基的主要原料组分按质量百分比计为葡萄糖4. 6%、酵母粉I. 5%、市政自来水，用氢氧化钠溶液调节pH值为6. 23，配料体积25m3 ;发酵温度控制在30±2°C、pH 值自然变化、空气量需要控制在O. 8 I. OmVm3发酵液/min，罐内压力在O. 25MPa，搅拌速度60转/min，在该初始发酵过程中控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，当发酵液中葡萄糖含量低于3wt%，开始流加浓度在10 30wt%的无菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到3. 5wt% 时终止；并在发酵初始的16h内根据泡沫产生情况加入食用油，食用油加入量按体积百分数计为发酵液体积的O. I O. 3wt% ；
初始发酵工艺控制见下表I :
表I
权利要求
1.利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，它包括以下步骤(1)原始菌株的活化将高山被孢霉菌株斜面培养，获得高山被孢霉的孢子悬液；(2)种子培养将高山被孢霉的孢子悬液接种于摇瓶培养基中振摇培养获得种子培养液；(3)种子扩大培养根据最终发酵罐的大小，将步骤(2)的种子培养液逐级扩大培养， 获得种子扩大培养液；(4)发酵培养，包括初始发酵阶段和后发酵阶段初始发酵阶段将步骤(3)的种子扩大培养液接种于发酵罐中进行搅拌培养，所述发酵培养基的主要组成成分按质量百分比计为葡萄糖4飞％、酵母粉广3%、市政自来水，pH值5 7，在该初始发酵过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，并在发酵初始的16h内根据泡沫产生情况加入食用油，食用油的加入量按体积百分数计为发酵液体积的O. Γ0. 3% ；当发酵液菌浓达到40% (体积比),干菌体总油达到40wt%时,初始发酵过程结束,进入后发酵阶段；后发酵阶段将上述发酵液降温至25±2°C，同时加入无菌氨水，调节pH值为8 9，静置发酵，在发酵过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖含量在I. (Tl. 5wt%,并在花生四烯酸含量高于40wt%后停止补加葡萄糖；当发酵液中花生四烯酸的含量高于45wt%时，后发酵阶段结束；(5)将发酵液经发酵后处理得到含有花生四烯酸的油脂。
2.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述的步骤(I)为将高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28 土 1°C下培养 8^10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬液。
3.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述的步骤(2)为将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28土1°C下振摇培养48h，摇床振摇转速为200±20转/分钟，培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖4飞％、蛋白胨广2%、酵母浸膏2 4%、基质蒸馏水，pH值为7 ± O. 2。
4.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(3)的种子培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖5 10%、酵母粉广3%、食用油O. Γ0. 3%、市政自来水，自然pH值，并在菌浓达到20% (体积比)时进行下一步扩大培养。
5.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(3)中的每级培养时间为24 32h，培养温度为30±2°C，空气流量为O. 8^1.0 m3/ m3发酵液/min,罐内压力在O. 15 O. 2MPa。
6.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(4)中的初始发酵温度控制为30±2°C、pH值自然变化、空气流量为O.8 I. OmVm3发酵液/min，罐内压力在O. 2 O. 3MPa。
7.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(4)中流加的葡萄糖为l(T30wt%的无菌葡萄糖溶液。
8.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(4)中初始发酵阶段的搅拌速度为5(Γ70转/min。
9.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述步骤(4)中后发酵阶段的空气流量为I. (Tl. 5m3/m3发酵液/min，罐内压力在 O. 2 O. 3MPa。
10.根据权利要求I所述的利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其特征在于，所述的步骤(5)为将发酵液依次经灭活、菌液分离、干燥、微生物油脂提取处理。
全文摘要
本发明提供了一种利用高山被孢霉生产花生四烯酸的工业方法。其特征在于，它包括以下步骤原始菌株的活化；种子培养；种子扩大培养；发酵培养，包括初始发酵阶段将种子扩大培养液接种于发酵罐中进行搅拌培养，并根据情况补加葡萄糖和食用油，当发酵液菌浓达到40%(体积比)，干菌体总油达到40wt%时，初始发酵阶段结束，进入后发酵阶段将上述发酵液降温至25±2℃，同时加入无菌氨水调节pH值为8~9，静置发酵，同时控制葡萄糖含量；当花生四烯酸的含量高于45wt%时，后发酵阶段结束；将发酵液经发酵后处理得到含有花生四烯酸的油脂。该方法简化了发酵配方，通过特定的工艺控制可使花生四烯酸的单位产量达到10gARA/L发酵液；工艺简便，易于控制，实现工业化生产。
文档编号C12R1/645GK102925502SQ20111022815
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者唐孝鹏, 汪志明, 张玉良, 朱子清 申请人:嘉必优生物工程(湖北)有限公司