专利名称：猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒CTransmissible gastroenteritis virus,TGEV)是引起仔猪腹泻的主要肠道病毒， 二者均属冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，单链正股RNA病毒，都能造成肠绒毛的萎缩或变短，均有类似的传染途径和临床症状，感染猪均表现为水样腹泻、呕吐、脱水及新生仔猪的高死亡率。在全世界范围内广泛发生。由于传染性胃肠炎和流行性腹泻的临床表现、病理变化、流行病学等方面都非常相似，但两病原没有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此给这两种病的诊治和预防带来了一定困难。诊断这两种疾病的传统方法有病毒分离、电镜检测、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。虽说上述方法能够鉴别诊断这两种病， 但由于实验方法的限制，导致检测耗时过长，无法在病毒感染初期进行诊断。近年来，随着分子生物学的发展，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)在PEDV和TGEV检测方面的应用越来越广泛，与传统的方法相比较，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便，但步骤繁杂、假阳性较多、缺乏准确定量、灵敏度不够高等妨碍了 RT-PCR在实际临床中的应用。1995年美Perkin Elmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术， 从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外，使PCR技术得到更新和发展，从而广泛地应用于临床以及其它相关核酸的研究。本发明首次将荧光RT-PCR技术应用于同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测领域，提供了针对猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的特异性引物、 探针序列、试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸序列，包括引物和探针。本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案
本发明提供了检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的引物和探针，具体如
下
通过序列比较，根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV Miller M6株N基因的序列(GenBank DQ811785)，在其保守区27832-27938位置设计一对引物及一条探针
1) TGEV 正义引物(TGEV-F) 5，ACAATTCCTTCAGCAGATTAATGC3，(SEQ ID NO 1)；2)TGEV 反义引物(TGEV-R) 5，CCTCTTGCTCTGACCTTTCTG3，(SEQ ID NO 2)；
3)TGEV探针(TGEV-pr。be)5，(J0E)ATGCTCGYCCATCAGAAGTGGCAAA (TAMARA) 3’ (SEQ ID NO :3)，该探针的5，端标记报告荧光基团J0E，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA ；
其中，Y代表兼并碱基τ或C ；扩增目的片段为107bp。通过序列比较，根据猪流行性腹泻病毒PEDV CV777株N基因的序列(GenBank AF353511)，在其保守区27163-27348位置设计一对引物及一条探针
4)PEDV 正义引物(PEDV-F) 5，AACAAATCCAGGGCCACTT3，(SEQ ID NO 4)；
5)PEDV 反义引物(PEDV-R) 5，TAAACTGGCGATCTGAGCA3，(SEQ ID NO 5)；
6)PEDV 探针(PEDV-probe)
5，(FAM) TCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAAT (TAMARA) 3，(SEQ ID NO :6)，该探针的 5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ； 扩增目的基因大小为186bp。本发明还提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，由以下组分组成
1)RNA提取试剂；通常可以使用商业购买的RNA提取试剂盒或按照常规方法来提取 RNA，所述的试剂盒例如Qiagen公司的RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini kit, cat. no 52906)；
2)RNA标准品为猪传染性胃肠炎病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No :9;和猪流行性腹泻病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表 SEQ ID No 12 ；
3)实时定量RT-PCR反应液，其包括含有dNTP的RT-PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶，反转录酶，荧光定量PCR参比染料；检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，
优选为1X含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物0. 2μΜ、 反义引物0. 和荧光探针0. 4μΜ，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物0. 2μΜ、反义引物 0. 2μΜ和荧光探针0. 4μΜ，Taq DNA聚合酶2U，反转录酶5U，1 X荧光定量PCR参比染料；
进一步地，所述含有dNTP的RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，购自Takra， 货号 DRR064，其组成为 dNTP，5mM ；MgCL2,5mM ；KCl,80mM ；Tris-HCl，20mM ；0. 2% Triton X-100。所述反转录酶为PrimeScriptTMRT Enzyme Mix II购于大连宝生物公司(Takra)，货号DRR064，所述Taq DNA聚合酶可以是TaKafei Ex TaqTM HS，购自大连宝生物公司(Takra)， 货号DRR064。所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号DR0X01，所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成；
4)阴性对照=DEPC水；
5)DEPC水；ImLx2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于 18. OM Ω · CM。其中，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物为序列表SEQ ID No 1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No 3 所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团J0E，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ；检测猪流行性腹泻病毒的正义引物为序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表 SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’ 端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。本发明还提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒的使用方法
1.样品采集、运送及制备
具有腹泻症状的猪场，用50mL离心管收集腹泻物，置于4°C保鲜盒中，运送回实验室。 腹泻粪便用0. OlM PBS液稀释成10%的悬液，4000rpm离心20 min，取上清140 μ L。-70°C 冻存备用。2. RNA 提取
按照QIAGEN Viral RNA Mini试剂盒提供的方法提取病毒RNA，具体方法如下
(1)取560μ 1缓冲液AVL移入到1. 5ml离心管中；
(2)加入140μ 1细胞毒，在漩涡振荡器上混勻(1 )，室温(15°C -20°C)放置10分钟后瞬离；
(3)加入560μ 1无水乙醇，在漩涡振荡器上混勻(1 ),开盖前瞬离；
(4)小心取出630μ 1上述混合物，转移至柱子(事先放进2ml收集管中)，8000rpm离心 lmin，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管；
(5)重复步骤4)；
(6)小心打开柱子，加入500μ 1缓冲液AWl，8000rpm离心lmin，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管；
(7)小心打开柱子，加入500μ 1缓冲液AW2，14000rpm离心;3min，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管，继续HOOOrpm离心Imin ；
(8)把柱子放进1.5ml离心管(无RNA酶)中，弃去收集管，小心打开盖子，加入60μ 1 缓冲液AVE，盖上盖子，室温放置lmin，8000rpm离心lmin，弃去柱子，1. 5ml离心管中即为
病毒RNA。3.实时定量RT-PCR反应
96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。反应体系为20 μ L，见表1 表权利要求
1.一组检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于，所述核苷酸引物和探针为序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :6，其中序列SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO :2分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO 3为检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光探针，序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5分别为检测猪流行性腹泻病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO :6为检测猪流行性腹泻病毒的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于所述探针SEQ ID NO 3的5，端标记报告荧光基团J0E，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA。
3.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于所述探针SEQ ID NO 6的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
4.一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成1)RNA提取试剂；2)RNA标准品为猪传染性胃肠炎病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No :9;和猪流行性腹泻病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表 SEQ ID No 12 ；3)实时定量RT-PCR反应液，其包括含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，Taq DNA聚合酶，反转录酶，荧光定量PCR参比染料；4)阴性对照=DEPC水；5)DEPT/K ；其中，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物为序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序列， 反义引物为序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团J0E，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ；检测猪流行性腹泻病毒的正义引物为序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
5.根据权利要求4所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂为RNA提取试剂盒。
6.根据权利要求4所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量RT-PCR反应液包括1 X含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物0. 2μΜ、反义引物0. 和荧光探针0. 4μΜ，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物0. 2μΜ、反义引物0. 2μΜ和荧光探针0. 4μΜ, Taq DNA聚合酶2U，反转录酶5U， IX荧光定量PCR参比染料。
7.根据权利要求6所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述含有dNTP的RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，所述荧光定量PCR 参比染料为ROX Reference Dye，所述7 ^ DNA聚合酶为T1^faTfe Ex Tagm HS，所述反转录酶为 PrimeScript RT Enzyme Mix II。
全文摘要
本发明公开了猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。所述检测用引物和探针为序列表SEQIDNO1至SEQIDNO6，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO3为检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光探针，序列SEQIDNO4和SEQIDNO5分别为检测猪流行性腹泻病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO6为检测猪流行性腹泻病毒的荧光探针。本发明还提供了猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，在猪腹泻物中所提取的病毒总RNA不需要先转录成cDNA，cDNA第一链的合成与双重PCR一步完成，且一次能检测两种病毒，提高效率。
文档编号C12N15/11GK102277454SQ20111024054
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者刘邓, 徐丽华, 李军星, 王一成, 袁秀芳 申请人:浙江省农业科学院