一种t载体及其构建方法与其前t载体的制作方法

专利名称：一种t载体及其构建方法与其前t载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及生物工程技术领域，涉及一种基因工程操作中的DNA片段克隆方法。具体地，本发明涉及一种T载体及其构建方法与其前T载体。
背景技术：
DNA的重组技术，也就是基因克隆技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。广义来说，DNA的重组技术是指利用供体生物的遗传物质， 或人工合成的DNA分子，经过体外的分离纯化、PCR扩增、限制酶切割等处理后与适当的载体连接起来形成新的重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入受体生物中，从而实现对目标 DNA分子的保存、扩增和分析等操作。可以作为DNA载体的有质粒、粘粒、噬菌体、人工染色体等，其中质粒载体是应用最为广泛的分子克隆载体。一个完整的基因工程质粒载体包括复制子(用于控制质粒分子在宿主体内的复制与扩增)、筛选基因(如抗性基因、报告基因，或两者都有，用于确认、跟踪或分离带目标质粒的宿主)、多克隆位点(便于DNA分子的切割与连接)以及用于控制质粒行为(如拷贝数)或用于分析的一些特别的DNA序列(如用于质粒测序的一些引物互补序列等)。DNA分子的切割与连接可以通过限制性内切酶和连接酶来完成，即分别用相应的限制性内切酶切割目标DNA分子和载体DNA分子，使其两端分别获得含有部分单链突出的末端(粘性末端)，含有互补序列的末端(由同一个酶或同尾酶切割获得)在DNA连接酶的作用下形成一条完整的DNA链。PCR技术的产生与发展使得利用PCR技术获得待克隆的DNA分子成为一种方便而高效的手段，但对于利用PCR方法获得的片段而言，采用限制酶切割的方法获得与载体匹配的末端有诸多不便首先，需要在PCR产物两端引入相应的酶切位点，增加了引物的成本；其次，当限制性内切酶识别位点位于DNA片段的末端时，其切割效率受影响；再次，用限制性内切酶处理后，正确切割或未切割的DNA分子难以分离，这将影响后续DNA片段与载体的连接效率。因此，一种针对PCR片段的克隆技术——TA克隆——得到发展并被广泛使用。TA克隆技术是指把PCR片段与一个具有单个3’ -dT突出的载体DNA分子连接起来的方法。其原理在于，在PCR反应中所使用的如Taq等DNA聚合酶具有末端转移的活性， 该活性使得其能在PCR扩增得到的DNA分子末端的3’端添加一个突出的dA,从而可以与具有3’-dT突出的载体DNA分子互补连接。与限制性内切酶切割后连接的方法相比，TA克隆使得通过PCR获得的DNA片段可以直接克隆到载体中，大大简化了克隆过程，提高了效率。 经过特别设计和加工制备的两端具有3’ -dT突出的线性DNA载体则称为T载体。T载体是TA克隆技术的核心，目前常用的T载体制备方法有两种一种是平末端添T法，即在环状的质粒载体(T载体前体)预设位置处用合适的限制性内切酶(如EcoR V, Sma I等)切割，形成两端为平末端的线性DNA分子，随后用带有末端转移酶活性的酶在合适的条件下在线性DNA分子的两端添加一个3’-dT，经过进一步纯化，获得制备好的T载
3体；另一种制备T载体的方法是酶切法，该方法利用某些限制性内切酶(如km I， Eaml 105 I等)切割后在3’留下单个核苷酸的特性，经过精心设计，使得该位置的核苷酸为T，因此，在载体上设计两个串联的该酶的识别位点，则切割后在载体的两端分别获得一个突出的3’ -dT，回收该线性DNA分子即为T载体。

发明内容
本发明的目的在于提供一种T载体及其构建方法与其前T载体。本发明首先公开了一种T载体，为两个末端均带有3’_dT突出的线性载体，所述两个3’ -dT突出末端的旁侧序列满足当经所述T载体与两端带3’ -dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成两个限制性内切酶酶切位点；所述两个限制性内切酶酶切位点为同一种限制性内切酶的酶切位点。所述限制性内切酶酶切位点可以是，但不局限于Hind III酶切位点。所述T载体中还应当带有其他T载体常用的必须元件。所述T载体常用的必须元件包括复制子、抗性基因(如氨苄青霉素基因表达盒) 和筛选标记(如lacZ’标记基因等)。T载体中还可选择性地包括下列元件用于控制质粒行为(如拷贝数)或用于分析的一些特别的DNA序列等。较佳的，所述T载体与两端带3’_dA的PCR产物相连后，除PCR产物自带的限制性内切酶酶切位点外，仅含有两个限制性内切酶识别位点。T载体中没有其他常用的限制性内切酶识别位点，可以用通用引物进行DNA序列测定。本发明的T载体可采用以下任一方法制备获得方法一用产生平末端的酶酶切前T载体后，产生带有平末端的线性分子，随后在所述线性分子的末端添T后获得。产生平末端的酶可以是，但不局限于EcoR V。线性分子末端添T的酶可以是，但不局限于Taq DNA polymerase0具体的，线性分子末端添T的方法可以为在dTTP存在的情况下，利用Taq DNApolymerase的作用下添加一个dT突出到DNA的3’末端。方法二 用产生3’ -dT突出末端的酶酶切前T载体后获得。所述产生3’ -dT突出的酶可以是，但不局限于km I。本发明还进一步公开了一种前T载体，可用于制备所述T载体。本发明的前T载体为环状的质粒载体，包括多克隆位点，其中所述多克隆位点包含一段共有下列五个酶切位点的DNA片段，两个产生3’ -dT突出末端的酶切位点，两个鉴定用酶切位点和一个产生平末端的酶切位点；所述产生平末端的酶切位点位于两个产生 3’ -dT突出末端的酶切位点之间；所述产生3’ -dT突出末端的酶切位点经产生3’ -dT突出末端的酶酶切后在载体上能产生两个3’-dT突出末端；所述两个3’-dT突出末端的旁侧序列满足当经产生3’ -dT突出末端的酶酶切后的所述载体与带3’ -dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成两个鉴定用酶切位点；所述两个鉴定用酶切位点为同一种酶的酶切位点ο所述产生3’ -dT突出末端的酶切位点可以是，但不局限于km I酶切位点。
所述鉴定用酶切位点可以是，但不局限于Hind III酶切位点。所述产生平末端的酶切位点可以是，但不局限于EcoR V酶切位点。优选的，所述产生3’_dT突出末端的酶切位点为km I酶切位点，所述鉴定用酶切位点为Hind III酶切位点，所述产生平末端的酶切位点为EcoR V。所述前T载体的多克隆位点中，除此上述五个酶切位点外，不含其它常见的限制性内切酶酶切位点。进一步的，所述DNA片段的序列为SEQ IN NO :1。所述前T载体应当与其他常用质粒载体一样，包括一些必须的元件，如复制子、抗性基因(如氨苄青霉素基因表达盒)和筛选标记。还可选择性地包括用于控制质粒行为 (如拷贝数)或用于分析的一些特别的DNA序列等。进一步的，所述前T载体可由为将现有的质粒载体的多克隆位点采用前述DNA片段替换获得。现有的质粒载体可选自pUC19、pUC18、pUC119、pUC118、pUC57、pBlueSciptll SK(+/-)>pBlueScript II KS(+/-)、pGEX_2T、pGEX_4T、pGEX_6p、pGEM-Z、pTZ19u、pTZ19r、 pTZ18u、pTZ18r、pBR322及其衍生载体、pACYC及其衍生载体、pSClOl及其衍生载体等。进一步的，所述前T载体为将pUC19经Hind III和EcoR I酶切后连入下列序列的片段获得5 ‘ -AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3‘I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I3 ‘ -GCGTGCGGTTCGAAGCGAACCCTATAGGTTCTCTTCGAACCTAGCATGGCAGTTTAA-5‘上述片段可按照设计好的序列，人工合成两条互补的DNA单链分子，经过退火后获得。本发明的前T载体经过处理后，可以获得两端带有3’ -dT突出的线性载体(即T 载体)，该载体可以直接与带有3’-dA突出的PCR产物进行高效连接，而且连接产物进行转化后，可以用蓝白斑和单酶切的方法鉴定转化子，极大地简化了检测流程。采用本发明的方法生产的TA克隆载体(T载体)具有如下优点1、与目前商业上通常使用的T载体相比，去除了载体上多余的酶切位点，避免载体上存在的位点和插入片段中设计的位点发生干扰；2、在两个km I位点之间插入一段较短的DNA序列，增大两个km I位点之间的距离，避免生产过程中由于两个km I位点过近带来的酶切不完全等问题，同时，该km I 双酶切后掉下的片段为20bp，可以使用PCR产物纯化的方法清除，简化了生产步骤，而且避免胶回收过程对DNA的损伤；3、在两个km I位点之间引入一个EcoR V酶切位点，该位点的引入，使得该载体对于两种生产方法均适用(Xcm I酶切法和EcoR V酶切后平末端添T法)；4、在T突出两端设计两个Hind III位点，可以用单一的酶Hind III进行插入子鉴定，该位点的设计使得载体具有如下特点A、对于有插入片段的载体，Hind III酶切后将切下和插入片段大小一致的片段；B、对于掉T自连的载体，Hind III不能切割；C、对于酶切不完全自连的载体，Hind III酶切后掉下25bp片段，大小可以在琼脂糖凝胶上分开；
5、经过序列优化，使得无论是由于km I酶切不完全或者因为两端掉T的情况，载体自连所产生的转化子均为蓝斑，从而降低假阳性率；6、插入位点两侧的距离经过优化，如使用M13通用引物进行测序，在获得良好的序列读取的同时，尽量减少载体序列残留。


图1是载体核心序列及其酶切位点位置示例图2是DNA单链互补退火形成的双链分子示意图
具体实施例方式本发明首先设计了一段DNA序列，使之具有如下特点1、该DNA片段可以被克隆至目标载体的多克隆位点中，比如pUC19 ；2、该片段不打断原来载体上编码IacZa蛋白的编码区，从而不破坏蓝白斑筛选的功能；3、该片段中含有两个km I酶切位点，两个Hind III酶切位点以及一个EcoRV酶切位点，除此之外不含其它常见的限制性内切酶酶切位点；4、两个km I酶切割后，留下的末端为3’ _dT突出；5、酶切位点之间的距离以及序列结果特别优化使之能实现本发明所述的功能。进一步，本发明按照上述思路合成了 DNA片段并将其克隆至pUC19载体中，经过 DNA序列测定，确认实际载体序列与预期设计序列一致；然后，对该载体进行处理，获得两端带有3’_dT突出的线性载体。此处有两种方法可以完成该步骤，第一种方法是平末端添T法，首先用EcoR V酶对载体进行切割，获得两端带有平末端的线性DNA分子，接下来采用DNA聚合酶在dTTP存在的条件下将dT添加到DNA 末端；第二种方法是，用km I酶对载体进行切割，两个km I位点处分别留下两个3’-dT 突出。具体地，本发明包括如下步骤(1)按照如前所述的思路设计DNA序列；(2)采用化学合成的方法获得两条单链DNA分子并通过退火的方法获得如前所述 DNA双链，该双链具有与载体通过酶切位点切割后留下的末端相匹配的末端；(3)对载体用相应的内切酶进行切割；(4)将步骤⑵中得到的DNA片段与步骤(3)中得到的酶切后的线性化载体进行连接，转化大肠杆菌，选择阳性转化子并经过DNA测序确认序列；(5)将步骤(4)中得到的载体，采用平末端添T法或km I酶切法制备带有3’_dT 突出的线性DNA分子；(6)用不同长度和来源的PCR产物验证步骤(5)中所获得的载体的连接效率。所述化学合成是指，采用有机合成的方法，将核苷酸单体按照所要求的序列依次连接，形成具有特定碱基排列顺序的DNA分子的过程；所述限制性内切酶是指，生物体内的一类可以识别并且切割特定双链DNA序列的内切核酸酶，带有该限制性内切酶识别序列的DNA分子经过处理后，留下固定的，特异的DNA末端序列；所述具有3’-dT突出的线性DNA分子是指，一种线性化的载体，在该载体的两个末端的3’端具有一个并且只有一个突出的T碱基，可以用于TA克隆，也被称为T载体；下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1载体核心序列设计示例及其构建1.1核心序列的设计根据本发明的设计思路，该载体的核心序列如SEQ ID NO. 1所示，具体的酶切位点以及其位置如图1所示。该核心序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。1. 2骨架载体的选择与制备为了简便起见，在本实施例中，采用pUC19载体作为骨架载体。将带有PUC19质粒的大肠杆菌DH5 α菌株接种于含有50ng/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C摇床中振荡培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“Sanft·印柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取PUC19质粒DNA。用限制性内切酶Hind III和EcoR I对pUC19质粒DNA进行酶切，Hind III和 EcoR I均购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司，反应体系如下
Buffer R (10 χ)5 yL
Η ηIII (10 U/μ L)IyL
EcoR I (10 U/μ L)1 yL
pUC19 Plasmid (50 ng/μ L) 10 μ L ddH20_33 μ L
Total volume50 μ L反应条件为37°C，3小时。反应结束后，用琼脂糖凝胶进行电泳，分离得到大小为2. 6kb的片段，利用胶回收的方法，用生工生物工程(上海)有限公司生产的“Sarfrep柱式DNA胶回收试剂盒” 按照其提供的步骤回收该条带。1. 3插入DNA片段的制备根据所设计的DNA序列，设计两条寡核苷酸DNA分子如下 pSGTSIF 5’-AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3，(SEQ ID NO 3)pSGTSIR 5’-AATTTGACGGTACGATCCAAGCTTCGCTTGGATATCCCAAGCGAAGCTTGGCGTGCG-3，(SEQ ID NO 4)这两条DNA分子由生工生物工程(上海)有限公司采用固相亚磷酰胺三酯法合
7成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行纯化，并且用质谱检测分子量与纯度。将两条DNA分子按照合成的量和其分子量计算，用TE buffer (IOmM Tris, ImM EDTA，pH 8.0)将其稀释至浓度为100 μ mol/L，等比例混合后，按照如下程序进行退火处理反应程序94°Cfor 2min，94°C down to 25°C at 0. 2°C per sec, 25°C for 8min。反应完毕后，获得互补的DNA双链，该DNA双链具有如图二中所示的结构，两端的突出分别于Hind III以及EcoR I酶切后的序列互补。1. 4DNA分子连接与转化将上述1.3中得到的DNA片段与1.2中得到的载体片度以摩尔比51的比例混合，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株感受态细胞，在氨苄青霉素抗性LB平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。挑取阳性转化子扩大培养，提取DNA，在生工生物工程(上海)有限公司用Sanger 法在3730型DNA序列分析仪上鉴定转化子的序列，挑取与预期序列完全一致的转化子用于后续实验，该正确的载体亦称为前T载体。实施例2 T载体制备方法一(平末端添T法)2. 1前T载体的准备将带有前T载体的大肠杆菌DH5 α菌株接种至含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C摇床振荡过夜。采用凯杰生物技术(上海)有限公司提供的“Qiagen Plasmid Maxi Kit”试剂盒按照厂商说明书提取质粒。2. 2载体线性化用EcoR V限制性内切酶对载体进行酶切，形成两端为平末端的线性化载体，反应体系如下
Buffer R (10 χ)20 μ L
EcoR V (10 U/μ L)5 μ LPre-T Vector (50 ng/μ L)50 μ L
ddH20_125 μ L
Total volume200 μ L酶切反应条件为37°C，3小时。酶切反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全，然后用生工生物工程(上海)有限公司生产的“Sarfrep柱式PCR产物纯化试剂盒”对酶切反应体系进行纯化，获得约为2. 61Λ的线性化DNA片段。2. 3 末端添 T首先配制10倍添T缓冲液(10x T-Tailing Buffer)，成分如下KCl150 mM
(NH4)2S04 150 mM MgCl220 mM
Trifon X-100 1% Tris-Cl100 mM
pH8.6按照以下反应体系进行添T反应
IOx T-Tailing Buffer20 μ L
dTTP (10 mM)5 μ L
lined DNA (50 ng/μ L)50 μ L
Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 5 μ L ddH20_120 μ L
Total volume200 μ L反应条件为72°C，2小时反应结束后，用生工生物工程(上海)有限公司生产的“Sarfr印柱式PCR产物纯化试剂盒”进行纯化，获得纯的DNA片段，该DNA片段末端带有3，-dT突出。实施例3T载体制备方法二(Xcm I酶切法)3.1前T载体的准备将带有前T载体的大肠杆菌DH5 α菌株接种至含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C摇床振荡过夜。采用凯杰生物技术(上海)有限公司提供的“Qiagen Plasmid Maxi Kit”试剂盒按照厂商说明书提取质粒。3. 2XcmI 酶切对3. 1中获得的前T载体进行酶切，如前所述，该前T载体中含有两个km I酶切位点，每个酶切位点将在最终线性化后的载体末端留下一个带3’-dT的突出。km I购自 NEB (北京)有限公司，反应条件如下
NEB Buffer 2 (IOx)20 μ L
Pre-T plasmid DNA (50 ng/μ L) 50 μ LXcm I (5 U/μ L)5 μ L
ddH20_125 μ L
Total volume200 μ L反应条件为37°C，3小时。酶切反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。3. 3T载体的回收与纯化用生工生物工程(上海)有限公司生产的“Sarfr印柱式PCR产物纯化试剂盒”进 9行纯化，获得纯的DNA片段，该DNA片段末端带有3，-dT突出。实施例4新型T载体的应用4. 1新型T载体连接效果测定设计3对引物，以Lambda DNA为模板，分别扩增长度为11Λ，2kb和51Λ的DNA片段，在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶得到DNA分子末端的3’端添加一个突出的dA的扩增产物。所述引物序列如下
引物名称引物序列(5’ -3’ )产物大小LlOOOFtaaattcgcacagcagcaac(SEQ ID N0:5)1000 bpLlOOORacgttttcaggttggcattc(SEQ ID NO:6)L2000Fcgcaaacttgtcacgctaaa(SEQ ID NO:7)2000 bpL2000Rtcggttgtatttccctccag(SEQ ID NO :8)L5000Fcatcggggtaaaaccgtcta(SEQ ID NO:9)5000 bpL5000Raacagtgcaccatgcaacat(SEQ ID NO:10) 反应体系如下
PCR Buffer (10 χ)5 μ L
MgCl2 (25 mM)3 μ L
L1000F/L2000F/L5000F (10 μ Μ)IyL
L1000R/L2000R/L5000R (10 μ Μ)IyL
Taq DNA Polymerase (5 U/μ L)2 yL
Lambda DNA (50 ng/ μ L)IyL
ddH20_37μ L
Total volume50 μ L反应程序94°Cfor 2min, (94°C for 30sec，58°C for 30sec,72°C for 3min)x 33 cycles,72°C for 8min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳显示在目标位置有明显的条带，用生工生物工程 (上海)有限公司生产的“Sarfrep柱式PCR产物纯化试剂盒”纯化该片段，分别与实施例 2和3所制备的T载体以摩尔比31的比例，在T4DNA连接酶的作用下进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株感受态细胞，转化后用含有50mg/L氨苄青霄素，0. ImM IPTG (Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,异丙基一β-D-iit 代半乳糖苷)禾口 40mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoIyI-D-Galactopyranoside, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖)的LB培养基平板上进行筛选，转化后的感受态经活
10化后涂布与上述平板上，于37°C倒置培养过夜。对平板进行蓝白斑计数确定蓝白斑比例，并用M13+/M13-引物(M13+5 ‘-GTAAAACGACGGCCAGT-3，(SEQ ID NO :11)，M13-:5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，(SEQID NO 12))对白斑进行PCR检测，测定白斑中含有正确插入片段的转化子的比例。结果如下
权利要求
1.一种τ载体，为两个末端均带有3’ -dT突出的线性载体，所述两个3’ -dT突出末端的旁侧序列满足当所述τ载体与两端带3’ -dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成两个限制性内切酶酶切位点；所述两个限制性内切酶酶切位点为同一种限制性内切酶的酶切位点。
2.如权利要求1所述T载体，其特征在于，所述限制性内切酶酶切位点为HindIII酶切位点。
3.如权利要求1所述T载体，其特征在于，所述T载体与两端带3’-dA的PCR产物相连后，除PCR产物自带的限制性内切酶酶切位点外，仅含有两个限制性内切酶酶切位点。
4.如权利要求1所述T载体的制备方法，为用产生平末端的酶酶切前T载体后，产生带有平末端的线性分子，随后在所述线性分子的末端添T后获得。
5.如权利要求4所述T载体的制备方法，其特征在于，所述产生平末端的酶为EcoRV。
6.如权利要求4所述T载体的制备方法，其特征在于，所述线性分子末端添T时所用的 81Taq DNA polymerase
7.如权利要求1所述T载体的制备方法，为用产生3’-dT突出末端的酶酶切前T载体后获得。
8.如权利要求7所述T载体的制备方法，其特征在于，所述产生3’-dT突出的酶为XcmI。
9.一种前T载体，为环状的质粒载体，包括多克隆位点，其中所述多克隆位点包含一段共有下列五个酶切位点的DNA片段，两个产生3’ -dT突出末端的酶切位点，两个鉴定用酶切位点和一个产生平末端的酶切位点；所述产生平末端的酶切位点位于两个产生3’ -dT 突出末端的酶切位点之间；所述产生3’-dT突出末端的酶切位点经产生3’-dT突出末端的酶酶切后在载体上能产生两个3’-dT突出末端；所述两个3’-dT突出末端的旁侧序列满足当经产生3’ -dT突出末端的酶酶切后的所述载体与带3’ -dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成所述的两个鉴定用酶切位点；所述两个鉴定用酶切位点为同一种酶的酶切位点ο
10.如权利要求9所述前T载体，其特征在于，所述产生3’-dT突出末端的酶切位点为 Xcm I酶切位点，所述鉴定用酶切位点为Hing III酶切位点，所述产生平末端的酶切位点为 EcoR V。
11.如权利要求9所述前T载体，其特征在于，所述前T载体由现有的质粒载体中的多克隆位点采用所述DNA片段替换后获得。
12.如权利要求9或11所述前T载体，其特征在于，所述DNA片段的序列为SEQINNO.1。
13.如权利要求9所述前T载体，其特征在于，所述前T载体为将pUC19经HingIII和 EcoR I酶切后连入下列序列的片段获得.5 ‘ -AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3‘IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII.3 ‘ -GCGTGCGGTTCGAAGCGAACCCTATAGGTTCTCTTCGAACCTAGCATGGCAGTTTAA-5‘。
全文摘要
本发明提供了一种T载体及其构建方法与其前T载体。本发明的T载体为两个末端均带有3’-dT突出的线性载体，两个3’-dT突出末端的旁侧序列满足当所述T载体与两端带3’-dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成两个限制性内切酶酶切位点；所述两个限制性内切酶酶切位点为同一种酶的酶切位点。本发明还进一步提供了可产生所述T载体的前T载体。本发明构建的T载体可用于TA克隆，具有很高的克隆效率，且可以用单酶切的方法对阳性转化子进行鉴定。
文档编号C12N15/66GK102311968SQ201110242359
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者李威 申请人:生工生物工程(上海)有限公司