专利名称：女性生殖器癌症相关snp位点多重检测方法的建立的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域，涉及正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关 SNP 位点(包括 rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749 和 rs749292)的同时检测和分型。具体在 http: IIwm. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下载 SNP 位点 rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)侧翼的核苷酸序列，设计各位点适用于T-ARMS-PCR技术的内外特异性引物，对6个SNP位点进行单管多重PCR分型。本专利通过多重嵌合引物PCR技术和毛细管电泳两项改进，克服了常规单管四引物扩增受阻突变体系PCR不能多重检测的缺点，其高通量、简易快速的特点为女性生殖器癌症相关SNP位点的快速分型提供了新的手段，对研究我国女性生殖器癌症相关SNP位点的基因型分布和女性生殖器癌症的预防有重要意义。
背景技术：
在人类基因组序列中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymerphisms,SNPs)是最常见的变异。已有研究表明，SNP位点rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662(T > C)和rs889312(C > A)与亚裔女性的乳腺癌易感性相关，rs750749 (T >C)是子宫颈癌易感性相关位点，rs749292(G > A)是卵巢癌易感性相关位点。对这6个位点快速准确的分型有助于女性生殖器癌症的预防。在近年来发展出的多种SNP检测技术中，四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR),或两对交叉引物 PCR(PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP)因其操作简便、分型快速、费用低廉已被广泛应用。其原理为针对已知的突变，在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物，特异性内引物用来检测突变是否发生，外引物在PCR反应中和特异性内引物分别配对有选择性地扩增突变型与野生型个体基因；通过使外引物距突变点长度不同可以得到不同长度的特异性扩增片段，根据电泳图谱中片段大小和有无，可以判断突变是否发生以及个体的基因型。目前，T-ARMS-PCR仍以单重检测为主，少数实验室也能实现多重检测(Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR)，但其可同时检测的位点数量难以进一步提高，主要受到两个限制多重扩增的偏向性及琼脂糖电泳的分辨率。本实验通过引入多重嵌合引物PCR技术对T-ARMS-PCR进行了改进，在扩增初期使用特异性嵌合引物(即在特异性引物5’端引入通用序列)扩增，而扩增末期由通用引物引发扩增，从而在保证反应特异性的同时，降低了多重PCR的偏向性。此外应用分辨率较高的毛细管电泳(capillaryelectrophoresis, CE)替代琼脂糖电泳，建立了单管多重PCR同时检测女性生殖器癌症相关位点 rs4784227 (OT), rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)的六位点检测方法
发明内容
I.在 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下载 SNP 位点 rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G
>A)侧翼的核苷酸序列，设计适用于T-ARMS-PCR技术的引物。在内引物的3 ’端倒数第二位(-2位)引入一个人为错配碱基来提高延伸反应的特异性，并在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag-F和Tag-R)。使用Primer Premier5.0设计的引物序列如表I :表I表I多重T-ARMS-PCR分型所使用的引物信息
触齡弓丨物名称_序歹U (5，-3，)_IT￡
rs47S4 .77 Forward mner Pnmer (T 型〉ArTGTGACACTATArTAATAAAAAGTCCCAATTTGTAGTGTTTGaT50322
rs4784227-476T-2A-tagF -
tagR^) GTACGACTCACTATAGGGAATGGGAGTATTTACATCACAATAATgG30297
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAAIACTGACCCCTTTAGACACGG5
rs4784227-268-tagF-
Reverse outer primer:GTACGACTCACTATAGGGAGGGCTTCAACACAGTCAGTTC9
rs4784227-760-tagR-
rs 17.19648 Forward inner pnmer (G 型〕OTACGACTCACTATAGGGACACGCCTATTTTACTTGACACAaG50 269
rsl219648-278G-2A-tagR-4---
Reverse mneT pnmer (A^);GTACGACTCACTATAOGGACCArGCTCCATCCTTOAAGAaT40197
rs 1219648-321 T-2A-tagR-
F^^d uierPnm7,erGTACGACTCACTATAGGGACACAATGGCGCAGAATTA7
rsl219648-l62-tagR-*--
Revere outer primer:GTACG^CTCACTATAGGGACTGGACAGGTCArTGTGGTG7.5
rs!219648-509-tagR-
r^S0^662 Forward inner Primertc 型):AGGTGACACTATAGAAIACTCTCCTTAATGCCTCTATAGCTGTaC30259
rs3803662-275C-2A-tagF-
Reverse inner primer (T 型)AGGTGACACTATAGAATACCACAGTTTTAITCl I CGl I AacA75357
rs3803662-324A-2C-tagF-
Forw^d. ut_er prImerAGGTGACACTATAGAAI'AGTCCTTGGCTGTTCTGTGA10
rs3803662o-tagF--
Reverrse 0utfrr pnm^rAGGTGACACTATArrAATATCCCCAAGGAGACAAAGGTA7
rs3 803662-496-tagF-
rs889312 Forward inner Pnmer 巧型)AGGTGACACTATAGAATATGCCCCTGCTGGAGAAAGtA60213
rs889312-382A-2T_tagl
Reverse innerPnmer CC 型〕:GTACGACTCACTATAGGGATGATTTGTAGTCTCTTAATTTGCACAaG85340
rs889312^28G-2A-tagR-
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAATACCIGGGTCCTTAGCATTCC13
rs8 89312-126-tagF-
Reverse outer pnmerGTACGACTCACTATAGGGAATCTGTGCCCTGAAGTGAGTAG9
rs889312-557-tagR-
r=；7S0749 Forward inner primer CC 型)aOGTGACACTATAGAATAGAGGCTGAGAACTAATAATAATTTTcC50371
rs750749-275C-2C-tagF-
Reverse inner primer (T 型)CjTACGACTCACTATAGGGACTTCAGATGAAAACTGCTGTGTAAria、75226
rs750749-327A-2A-tagR-
pnTer:AGGTGACACTATA(]AATACCCACAGAGTTGGAATGCTT12
rs750749-139-tagF-
Reverse outer pnmer:GTACGACTCACTATAGGGATGCATAAAGTGGGTCCTGC7.5
rs750749-608-tagR--
rs749 .97 Forward mner pnmer (G 型)AGGTGACACTATAGAATACCTTCTTCAAACCTCGGAGTaG3 5282
rs749292-429G-2A-tagF-
Reverse inner primer (AM)OTACGACTCACTATAGGGAGATAGAAATTGTGCAGGAATCCaT25330
rs749292-472T-2A-tagR-
Fo^Hr pn^ier:AGGTGACACTATAGAATATCCACGGACAGAGCAGG4.5
rs749292-180-tagF-
^749292°673 亡__GTACGACTCACTATAGGGAGATTAGGGGACCTCCGTGA_7_注下划线处为通用引物标签序列(Tag);阴影部分的是为保证扩增特异性而特别设计的喊基，3’末端是多态位点，~2位是人为错配。2.建立了如下的检测过程，详见如下(I)合成引物特异性嵌合引物及上下游通用引物标签(Tag-F和Tag-R)由北京六合华大基因科技股份公司合成，PAGE纯化。(2)外周静脉血标本，采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取；口腔拭子DNA，采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取。(3)建立同时检测6个SNP位点的多重T-ARMS-PCR反应体系，并对其特异性进行验证。
具体实施例方式实施方案I :多重PCR扩增使用Multiplex PCR Kit(QIAGEN)试剂盒。PCR反应体系为20 yl，其中全血DNA模板0. 5 ill，口腔拭子DNA模板2 ill，通用引物500nM，其余引物浓度见表I。PCR反应分6步扩增目的片段第I步95°C预变性IOmin ;第2步95°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸45s，循环3次；第3步95°C变性30s，58°C复性30s，72°C延伸45s，循环10次；第4步95°C变性 30s，68°C 复性 30s，72°C延伸 45s，循环 20 次；第 5 步95°C变性 30s, 55°CM 性30s，72°C延伸45s，循环12次；第6步72°C延伸5min，4°C保存。每份标本做2个重复。实施方案2 :毛细管电泳分离米用QIAxcel system(Qiagen)毛细管电泳系统，QIAxcel DNA high-resolutioncartridge (Qiagen)及 0H700 方法作为分离条件，与 QX Alignment Marker 15bp/500bp、QXDNA Size Marker 25_450bp 配合使用，经 Biocalculator software (Qiagen)软件分析，以对应长度的产物是否存在进行SNP分型。实施方案3 :测序验证PCR反应体系25 u I，其中全血DNA模板0. 5 iU，口腔拭子DNA模板2 iU，PremixEx Taq Version 2. 0 (TakKaRa) 12. 5 U 1，各位点取不带 Tag 的外引物各 500nM。PCR 反应为95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C复性 30s，72°C延伸 45s，循环 45 次；72°C延伸 5min，4°C保存。将产物进行测序，并将测序结果与M-T-ARMS-PCR电泳结果进行对照。
权利要求
1.一种用于同时检测女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227 (C>T),rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技术，其中包括用于检测的rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G > A)的型特异性内、外引物。
2.权力要求I所述的多重PCR技术的引物和通用引物包括表I所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求I所述的多重PCR检测技术用于检测包括女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227(C > T)、rsl2196489(G > A)、rs3803662(T > C)、rs889312(C > A)、rs750749(T>C)和 rs749292 (G > A)。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关SNP位点(包括rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同时检测和分型。
5.权力要求I所述的同时检测女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227(C> T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技术的反应程序和检测程序。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，涉及正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关SNP位点(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下载SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)侧翼的核苷酸序列，设计各位点适用于T-ARMS-PCR技术的内外特异性引物，对6个SNP位点进行单管多重PCR分型。本发明通过多重嵌合引物PCR技术和毛细管电泳两项改进，克服了常规单管四引物扩增受阻突变体系PCR不能多重检测的缺点，其高通量、简易快速的特点为女性生殖器癌症相关SNP位点的快速分型提供了新的手段，对研究我国女性生殖器癌症相关SNP位点的基因型分布和女性生殖器癌症的预防有重要意义。
文档编号C12N15/11GK102965427SQ20111025778
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者马学军, 刘颖, 张晨 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所