专利名称：牵引丝蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸、由核酸编码的蛋白质、导入有核酸的重组生物及由重组生物制作的蛋白质。
背景技术：
蜘蛛的丝作为因兼具强度和弹性而具有优异强韧性的天然高性能聚合物而为人所知。蜘蛛中存在最多7个经特化的腺体，这些腺体产生性质不同的多种蜘蛛丝，其中由大壶状腺体产生的牵引丝作为最强韧的蜘蛛丝在医疗、航空、衣料等各种产业领域中的新原材料的开发中备受关注。作为构成牵引丝的主要蛋白质，已知被称作大壶状腺丝蛋白(Major Ampullate Spidroin =MaSp)的蛋白质，目前编码黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)、几何寇虫朱(Latrodectus geometricus) > ^ ^H^ (Nephila clavipes) 禾中■虫朱白勺 MaSp 胃白质的基因序列已经清楚(非专利文献1 :Nadia A. Ayoub et al. , Blueprint for a High-Performance Biomaterial :Full_Length Spider Dragline Silk Genes,2007, Issue 6, e514 ；非专禾丨J 文献 2 :ffilliam A. Gaines IV et al. , Identification and Characterization of Multiple Spidroin 1 Genes Encoding Major Ampullate Silk Proteins in Nephila clavipes, Insect Mol Biol，2008，17(5)，465-474 等)。
发明内容
但是，在各产业领域中，对具有优异物性的天然纤维的需求有所增加的同时，期待更新的原材料的开发。因而，本发明的目的在于提供在天然纤维中具有优异物性的新原材料。本发明人等为了达成上述目的反复进行了深入研究，结果发现，编码构成人面蜘蛛(N印hi la pillipes)的牵引丝的MaSp蛋白质的基因具有与目前已知的MaSp基因不同的独特结构，进而完成了本发明。SP，本发明涉及(1)下述(a) (d)中任一种的核酸。(a)具有序列号1或19的碱基序列的核酸(b)编码具有序列号2或20的氨基酸序列的蛋白质的核酸(c)与上述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸(d)在严格的条件下与上述(a)的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸另外，本发明涉及(2)核酸，其含有下述(e) (h)中任一种的核酸，并且其与具有序列号1的碱基序列的核酸具有70%以上、优选80%以上的序列同一性，并编码牵引丝蛋白。(e)具有序列号3、5、7、9、11、13、15或17的碱基序列的核酸(f)编码具有序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白质的核酸(g)与上述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸
(h)在严格的条件下与上述(e)的核酸的互补链杂交的核酸另外，本发明涉及(3)上述(2)所述的核酸，其与具有序列号1的碱基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。另外，本发明涉及(4)核酸，其含有下述(i) (1)中任一种的核酸，并且其与具有序列号19的碱基序列的核酸具有70%以上、优选80%以上的序列同一性，并编码牵引丝蛋白。⑴具有序列号21、23、25、27、29、31、33或35的碱基序列的核酸(j)编码具有序列号22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白质的核酸(k)与上述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(1)在严格的条件下与上述(i)的核酸的互补链杂交的核酸另外，本发明涉及(5)上述(4)所述的核酸，其与具有序列号19的碱基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。另外，本发明涉及(6)由上述(1) (5)中任一种的核酸编码的蛋白质。根据上述本发明的特定核酸，可以编码与现有MaSp蛋白质不同的具有优异物性的MaSp蛋白质(牵引丝蛋白)、从而提供天然纤维的新原材料。特别是，由本发明的核酸编码的牵引丝蛋白(本发明的蛋白质)具有比现有品更为优异的弹性(或弹力、伸缩性、伸长率、柔软性)，适合用于以医疗用品、衣料品等为代表的各种产业领域中需要弹性的用途中。而且，本发明涉及(7)导入有上述(1) (5)中任一种核酸的重组生物及(9)由上述(7)的重组生物制作的蛋白质。根据本发明的重组生物，可以生产大量的由上述核酸编码的物性优异的牵引丝蛋白。由上述重组生物制作的蛋白质通过含有物性优异的牵引丝蛋白，适合用于各种产业领域中。特别是，本发明涉及⑶导入有上述(1) (5)中任一种核酸的重组桑蚕及(10) 由该重组桑蚕制作的蚕丝。根据本发明的重组桑蚕，可以生产大量的含有由上述核酸编码的物性优异的牵引丝蛋白的蚕丝。由上述重组桑蚕制作的蚕丝通过含有物性优异的牵引丝蛋白，具有比现有蚕丝更为优异的物性、特别是更为优异的弹性。另外，本发明涉及(11)具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牵引丝蛋白。(m)序列号2或20的氨基酸序列(η)与上述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列另外，本发明涉及(12)具有下述(ο)或(ρ)的氨基酸序列的牵引丝蛋白。(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且与序列号2的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上的序列同一性的氨基酸序列(ol)序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列(02)与上述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列(ρ)具有下述(pi)或(p2)的氨基酸序列且与序列号20的氨基酸序列具有70% 以上、优选80%以上的序列同一性的氨基酸序列(pi)序列号22、24、沈、28、30、32、；34或36的氨基酸序列(p2)与上述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列另外，本发明涉及(13)上述(12)所述的牵引丝蛋白，其中，上述(ο)的氨基酸序列与序列号2的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性、上述(ρ)的氨基酸序列与序列号20的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性。而且，本发明涉及(14)具有下式(1)所示的氨基酸序列或与式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7-X8] n (1)上述式(1)中，m各自独立地表示0或1的整数、η表示1 10的整数、Xl表示序列号37 45中的任一种氨基酸序列、Χ2表示序列号46 52中的任一种氨基酸序列、Χ3 表示序列号53 59中的任一种氨基酸序列、Χ4表示序列号49的氨基酸序列、)(5表示序列号60或61的氨基酸序列、)(6表示序列号62 64中的任一种氨基酸序列、Χ7表示序列号 65 70中的任一种氨基酸序列、Χ8表示序列号71 81中的任一种氨基酸序列。上述本发明的蛋白质由于其独特的结构而具有比现有牵引丝蛋白更为优异的物性，因而适合用于各种产业领域中。根据本发明的核酸，可以提供具有优异物性的蛋白质。另外，根据本发明的重组生物，可以生产大量的具有优异物性的蛋白质。特别是，根据本发明的重组桑蚕，可以生产大量的具有优异物性的蚕丝。由本发明提供的牵引丝蛋白或蚕丝具有特别优异的弹性。如此， 根据本发明，可以提供弹性等物性优异的天然纤维的新原材料。
图1为表示NP-牵引丝蛋白A的cDNA序列的图。图2为表示NP-牵引丝蛋白A的氨基酸序列的图。图3为表示Northen杂交结果的照片图。图4为表示NP-牵引丝蛋白B的cDNA序列的图。图5为表示NP-牵引丝蛋白B的氨基酸序列的图。
具体实施例方式以下根据需要参照着附图详细地说明用于实施本发明的方式。但本发明并不限定于以下的实施方式。本发明涉及下述(a) (d)中任一种的核酸。(a)具有序列号1或19的碱基序列的核酸(b)编码具有序列号2或20的氨基酸序列的蛋白质的核酸(c)与上述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸(d)在严格的条件下与上述(a)的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸首先，本发明涉及具有序列号1或19的碱基序列的核酸(a)。序列号1或19的碱基序列均是对作为构成络新妇属人面蜘蛛(Nephila pilipes)的牵引丝的蛋白质主要成分的被称作大壶状腺丝蛋白(Major Ampullate Spidroin =MaSp)的蛋白质(多肽)进行编码的基因。本说明书中，将由具有序列号1的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作“NP-牵引丝蛋白A”、将由具有序列号19的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作“NP-牵引丝蛋白B”。这些核酸(a)不需要由人面蜘蛛获取，只要是具有序列号1或19的碱基序列，则可以通过人工合成或由基因组文库或cDNA文库获取，还可以是用PCR对它们进行扩增而得到的核酸或者用限制酶将它们进行切断而得到的核酸。
本发明的核酸还可以是编码具有序列号2或20的氨基酸序列的蛋白质的核酸 (b)。序列号2或20的氨基酸序列均为人面蜘蛛的MaSp蛋白质所具有的氨基酸序列。具体地说，序列号2的氨基酸序列为上述NP-牵引丝蛋白A所具有的氨基酸序列、序列号20 的氨基酸序列为上述NP-牵引丝蛋白B所具有的氨基酸序列。另外，本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白(MaSp)，则还可以是与具有序列号1 或19的碱基序列的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(C)。上述序列同一性只要为 90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。而且，本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白，则也可以是在严格的条件下与具有序列号1或19的碱基序列的核酸的互补链进行杂交的核酸(d)。本说明书中，核酸的“互补链”是指基于核酸的碱基间的氢键而相对应的核酸序列(例如T与A相对应、C与G相对应)。另外，“杂交”是指在上述互补链之间发生的互补键合或者单链核酸分子间的碱基对相互作用的形成。本说明书中，“严格的条件“是指相对于目标序列具有同源性的核苷酸链的互补链优先地与目标序列杂交、而不具有同源性的核苷酸链的互补链实质上不发生杂交的条件。 严格的条件是序列依赖性的，在各种状况下有所不同。越长的序列在越高的温度下特异性地发生杂交。一般来说，严格的条件选择比规定的离子强度和PH下的特定序列的热熔融温度(Tm)约低5°C。Tm是在规定的离子强度、pH和核酸浓度下与目标序列互补的核苷酸的50%以平衡状态与目标序列发生杂交的温度。“严格的条件”是序列依赖性的，随各种环境参数的不同而不同。核酸杂交的一般性方针可在Tijssen (Tijssen (199 、Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第 2 章"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay，，、Elsevier, New York)中找到。代表性地来说，严格的条件为盐浓度约小于1. OM Na+、代表性地是pH7. 0 8. 3下约0. 01 1. OM的Na+浓度(或其他的盐)，温度对于短核苷酸(例如10 50个核苷酸) 而言至少约30°C、对于长核苷酸(例如长于50个核苷酸)而言至少约60°C。严格的条件还可以通过添加甲酰胺等不稳定化剂来达成。作为本说明书中的严格的条件，可举出在50% 的甲酰胺、IM的NaCl、l %的SDS(37°C )的缓冲溶液中的杂交、和用0. IXSSC在60°C下的洗涤。另外，本发明的核酸只要是含有下述(e) (h)中的任一种核酸且编码牵引丝蛋白，则也可以是与具有序列号1的碱基序列的核酸具有70%以上的序列同一性的核酸。上述序列同一性只要为70%以上即可，优选为75%以上、更优选为80%以上、进一步优选为 85%以上、特别优选为88%以上。(e)具有序列号3、5、7、9、11、13、15或17的碱基序列的核酸(f)编码具有序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白质的核酸(g)与上述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(h)在严格的条件下与上述(e)的核酸的互补链杂交的核酸上述序列号3、5、7、9、11、13、15及17的碱基序列为在序列号1的碱基序列中在编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。通过含有具有这种特征序列的核酸，即便是与具有序列号1的碱基序列的核酸仅有70%以上的序列同一性的核酸，也可与具有序列号1的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白。具有序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序列号3、5、7、9、11、13、15或17的碱基序列编码的蛋白质。上述核酸(g)中，与核酸(e)的序列同一性只要为90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。另外，本发明的核酸只要是含有下述(i) (1)中任一种的核酸且编码牵引丝蛋白，则也可以是与具有序列号19的碱基序列的核酸具有70%以上的序列同一性的核酸。上述序列同一性只要为70%以上即可，优选为75%以上、更优选为80%以上、进一步优选为 85%以上、特别优选为88%以上。(i)具有序列号21、23、25、27、四、31、33或35的碱基序列的核酸(j)编码具有序列号22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白质的核酸(k)与上述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(1)在严格的条件下与上述(i)的核酸的互补链杂交的核酸上述序列号21、23、25、27、四、31、33及35的碱基序列是在序列号19的碱基序列中在编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。通过含有具有这种特征序列的核酸，即便是与具有序列号19的碱基序列的核酸仅具有70%以上的序列同一性的核酸，也可与具有序列号19的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白。具有序列号22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序列号21、23、25、27、29、31、33或35的碱基序列编码的蛋白质。上述核酸(k)中，与核酸(i)的序列同一性只要为90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。另外，本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组生物及由该重组生物制作的蛋白质。特别是本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组桑蚕及由该重组桑蚕制作的蚕丝。本说明书中，“重组生物”是指利用基因重组将外来基因导入至染色体中进行了转化的生物。作为被转化的生物，并无特别限定，可以使用昆虫、动物、植物、微生物等，优选使用昆虫。作为优选的昆虫，可以举出桑蚕(Bombyx mori)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)等。其中优选使用属于蚕蛾科的桑蚕、 野桑蚕等，特别优选使用桑蚕。本说明书中，“桑蚕”是指蚕蛾属桑蚕(Bombyx mori) 0桑蚕可以是实验用的品种也可以是经实用商品化的实用品种。另外，“重组桑蚕”是指利用基因重组将外来基因导入至桑蚕染色体中进行了转化的桑蚕。基因重组例如通过使用转座子的方法来进行，但只要是能够将外来基因导入至桑蚕中的方法则没有限定，还可以通过电穿孔法等其他的方法来进行基因重组。本说明书中，“蚕丝”是指由桑蚕(Bombyx mori)吐出的纤维，其构成茧，以丝蛋白为主成分。丝蛋白由大小2个亚单元(H链及L链)构成。本说明书中，“人面蜘蛛”是指络新妇属人面蜘蛛(N印hila pilipes)，对人面蜘蛛的产地并无特别限定。另外，本发明涉及具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牵引丝蛋白。(m)序列号2或20的氨基酸序列(η)与上述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列上述氨基酸序列(η)中，与上述(m)的氨基酸序列的序列同一性只要为90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。另外，本发明涉及具有下述(O)或(ρ)的氨基酸序列的牵引丝蛋白。(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且与序列号2的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列(ol)序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列(02)与上述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列(ρ)具有下述(pi)或(p2)的氨基酸序列且与序列号20的氨基酸序列具有70% 以上的序列同一性的氨基酸序列(pi)序列号 22,24,26,28,30,32,34 或 36 的氨基酸序列(p2)与上述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列上述氨基酸序列(ο)中，与序列号2的氨基酸序列的序列同一性只要为70%以上即可，优选为75 %以上、更优选为80%以上、进一步优选为85 %以上、特别优选为88%以上。同样地，上述氨基酸序列(ρ)中，与序列号20的氨基酸序列的序列同一性只要为 70%以上即可，优选为75%以上、更优选为80%以上、进一步优选为85%以上、特别优选为 88%以上。另外，上述氨基酸序列(02)中，与上述(ol)的氨基酸序列的序列同一性只要为 90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。同样地，上述氨基酸序列(p2)中，与上述(pi)的氨基酸序列的序列同一性只要为 90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。进而，本发明涉及具有以下式(1)所示的氨基酸序列的蛋白质。[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7-X8] n (1)上述式(1)所示的氨基酸序列具有η个由[Xl-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7_X8] 所示的重复单元。对重复单元的数量(η)并无特别限定，优选为1 10、更优选为2 9、 进一步优选为3 8、特别优选η = 8。式(1)中，m各自独立地表示0或1的整数。即，每个重复单元中，既有具有X4、X5 或X6所示的氨基酸序列的情况，也有不具有X4、X5或)(6所示的氨基酸序列的情况。式(1)中，Xl表示序列号37 45中的任一种氨基酸序列、X2表示序列号46 52中的任一种氨基酸序列、X3表示序列号53 59中的任一种氨基酸序列、X4表示序列号 49的氨基酸序列、)(5表示序列号60或61的氨基酸序列、)(6表示序列号62 64中的任一种氨基酸序列、X7表示序列号65 70中的任一种氨基酸序列、X8表示序列号71 81中的任一种氨基酸序列。另外，本发明的蛋白质还可以是具有与上述式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。上述序列同一性只要为90%以上即可，优选为93%以上、更优选为95%以上、进一步优选为98%以上。图1是表示作为人面蜘蛛的MaSp蛋白质中的1种的NP-牵引丝蛋白A的cDNA序列的图。图1所示的基因序列与序列号1的碱基序列相同。图2是表示由具有图1所示基因序列(序列号1的碱基序列)的核酸编码的NP-牵引丝蛋白A的氨基酸序列的图。图2所示的氨基酸序列与序列号的碱基序列相同。另外，图4是表示作为人面蜘蛛的MaSp蛋白质中的另1种的NP-牵引丝蛋白B的 cDNA序列的图。图4所示的基因序列与序列号19的碱基序列相同。图5是表示由具有图4所示基因序列(序列号19的碱基序列)的核酸编码的 NP-牵引丝蛋白B的氨基酸序列的图。图5所示的氨基酸序列与序列号20的碱基序列相同。如图2或图5所示，由具有序列号1或19的碱基序列的核酸编码的牵引丝蛋白是由下述式( 所示的氨基酸序列构成的。[(a) (V) (β)], (2)上述式⑵所示的氨基酸序列具有q个[(a) (V) (β)]所示的重复单元。对重复单元的数量(q)并无特别限定，只要为1 100即可，优选为1 10、更优选为2 9、进一步优选为3 8、特别优选q = 8。上述式O)中，(α)是由连续具有2 4个GGX的富含甘氨酸的序列构成，表示形成非结晶性α-螺旋结构的无定形区域。(V)表示GX含有率高的伪结晶区域、(β)表示富含丙氨酸或苏氨酸的形成β折叠的结晶区域。上述(α)及(V)所含的X多为谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸等，但并不限定于这些，还可以是其他的氨基酸。另外，X并不必须是相同的氨基酸。以下，对图2或图5所示的牵引丝蛋白所具有的独特的分子结构以及由此获得的牵引丝蛋白的物性进行说明。首先，在图2或图5所示的牵引丝蛋白的(α)区域(非结晶性无定形区域)中， 4个GGX连续地排列。通过这种排列，牵引丝形成α-螺旋结构。α-螺旋结构通常在纤维中以弯曲的状态存在，通过拉伸而沿着纤维轴变成直链状结构。这样，相对于来自外部的应力，α-螺旋结构大幅度伸展，从而赋予纤维以弹性。另一方面，以往公知的蜘蛛牵引丝蛋白(MaSp)中未见4个GGX连续排列的结构(参照非专利文献1、2等)。由以上可知，通过在(α)区域中形成4个GGX连续排列的独立结构，由本发明获得的牵引丝蛋白的弹性(或弹力、伸缩性、伸长率、柔软性)变得优异。此外，以下文献也记载了 GGX重复基序赋予丝以弹性。· Cheryl Y. Hayashi et al. , Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks, 1998, p.779· Thomas Scheibel, Spider si Iks !recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins, 2004, p.2另外，图2或图5所示的牵引丝蛋白的(V)区域(伪结晶区域)中富含亲水性氨基酸。如表1所示，图2或图5所示的牵引丝蛋白与目前公知的金丝蜘蛛(N印hi la clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛(Nephila clavata)的牵引丝蛋白相比，含有更多的亲水性氨基酸。 由此认为，由本发明获得的牵引丝蛋白的吸湿性变高。另外认为，牵引丝蛋白的结晶化度低也成为使吸湿性增加的要因。而且，在图2或图5所示的牵引丝蛋白的(β)区域(结晶区域)中，在聚丙氨酸的间隔间含有苏氨酸、天冬酰胺等极性氨基酸。认为由本发明获得的牵引丝蛋白通过如此具有极性氨基酸丰富的聚丙氨酸(Poly(A))基序，变得具有优异的强韧性。此外，以下的文献也记载了极性氨基酸丰富的聚丙氨酸(Poly(A))基序赋予丝以强韧性。· Glareh Askarieh et al. , Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH—sensitive relay, 2010, vol.465, p. 1*J. M. G0SLINE,et al.，THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS :FR0M FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION,1999, p.3299另外，如表1所示，图2或图5所示的牵引丝蛋白相对于以往公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes)或日本产横带人面蜘蛛(N^hila clavata)含有约2倍的极性氨基酸。这样大量存在于分子内的极性氨基酸残基通过相对于来自外部的应力沿着应力的方向规则地排列分子、增大分子间的作用力，从而使牵引丝具有优异的强度。特别是认为分子间的氢键有助于丝纤维的强度增加。表1示出人面蜘蛛(Nephila pilipes)、金丝蜘蛛(Nephila clavipes)、日本产横带人面蜘蛛(Nephila clavata)的MaSp蛋白质中的极性氨基酸及亲水性氨基酸的含有率 (% )0 此外，极性氨基酸的含有率表示 N (Asn)、C (Cys)、Q (Gln)、S (Ser)、T (Thr)及 Y (Tyr) 的含有率，亲水性氨基酸的含有率表示R(Arg)、N(Asn)、D(Asp)、Q(Gln)、E(Glu)、H(His)、 K (Lys)、S (Ser)及 T (Thr)的含有率。表1
极性氨基酸(％)亲水性氨基酸(％ )人面蜘蛛31. 0529. 41金丝蜘蛛15. 7114. 85曰本产横带人面蜘蛛15. 1511. 01实施例以下举出实施例更加具体地说明本发明。但本发明并不限定于以下的实施例。作为受试动物，使用7月采集的人面蜘蛛(N印hila pilipes)的雌成虫。(RNA 抽提)总RNA由人面蜘蛛(N^hila pilipes)的大壶状腺体准备。在生理盐水(NaCl 0. 75% )中解剖蜘蛛的大壶状腺体，添加Iml的TRIZOL并充分粉碎。悬浮液用200 μ 1的氯仿进行分离除去。将水层移至其他的管中，添加等量的异丙醇，使RNA沉淀。用75%乙醇淋洗沉淀物，在-80°C下进行保存。之后，在7500rpm、4°C下离心分离5分钟，真空干燥8分钟后，溶解于无RNase水中。在55°C下将RNA溶解10分钟后，作为样品使用。确认了通过对样品进行琼脂糖电泳，可以抽提出RNA。(cDNA文库的构建)
利用G-封端(G-Capping)法来合成和构建大壶状腺体的cDNA文库委托给了 Takara-bio株式会社。文库载体(pDNR-LIB)溶解于约50μ 1的TE中。(克隆和测序)为了以高概率进行转化，使用了电穿孔法。作为DNA溶液，使用准备好的cDNA文库溶液；作为感受态细胞，使用hvitrogen公司制“Electro MAX DHl2S Cells”(Cat. No. 18312-017)，使用0. Icm尺寸的样品池。首先，预先在冰上冷却样品池，在冰上溶解放入在管中的感受态细胞(> IOltlCfu/ μ g) 50 μ 1后，将1 μ 1的cDNA文库溶液添加于管中。将该混合液均一地移至样品池中。电穿孔的条件是电压为2. 5kV、脉冲控制器(R2_7)为200 Ω、电容为25 μ F。施加一次脉冲，尽快在样品池内添加Iml的SOC培养基胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、IOmM NaCl,2. 5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4、20mM葡萄糖)，将溶液悬浮。将悬浮液移至培养管中培养1小时 1个半小时后，接种于含抗生素(氨苄青霉素)、IPTG及X-Gal的LB板(1 %胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5% NaCl)中。将在板上形成的白色菌落植菌至LB(+氨苄青霉素)培养基中，随机选择588个重组质粒，使用Flexift·印111Kit (Amersham公司制)进行纯化。(测序与序列的比较解析) 入白勺；！5 歹[J iiffi “ABI Prism genetic analyzer 3100" (Life technologies Japan株式会社制)和T7引物进行分析。DNA和氨基酸序列的计算机分析使用“Genetyx package”(株式会社 Genetec 制)和 “^quencher 4. 14" (Demo Version) (Gene Codes 公司制)进行。序列的比较通过对蛋白质的数据库利用ExPASy Proteomics server (http// www.expasy.org)的 SIB BLAST Network 进行同源性分析。(证明丝腺特异性表达的实验)MaSp (major ampul late spidroin)如名称所示，是在大壶状腺体进行表达。为了证明本发明的基因在大壶状腺体内起作用，进行使用cDNA序列的3’末端(氨基酸序列的 C末端)序列制作的探针与由蜘蛛的四种丝腺(鞭状腺、管状腺、大壶状腺体、小壶状腺体) 抽提出的RNA的Northern杂交实验。图3为表示Northern杂交的结果的图。图3的条带 1 4依次流过由鞭状腺、管状腺、大壶状腺体、小壶状腺体抽提出的RNA。由此结果可知， 本发明的基因(核酸)在人面蜘蛛的大壶状腺体内特异性地表达。另外，推测转印物质的分子量约为3 41Λ。(牵引丝的物性评价)为了比较人面蜘蛛的牵引丝和目前公知的蜘蛛的牵引丝的物性，测定各自的伸长率(弹性模量)。伸长率的测定如下进行将在从测定前一天开始在20°C、RH65%下放置 24小时而调整了吸湿量的20mm的各牵弓丨丝为样品，在20°C、RH65%下、在拉伸速度为20mm/ min的条件下进行使用了拉伸试验机“Tensilon UTM-II1-100” (Toyo Baldwin公司制)的伸长率试验。作为目前公知的蜘蛛，使用日本产横带人面蜘蛛(Nephila clavata)及横纹金蛛(Argiope bruennichi)。将结果示于表2。表权利要求
1.下述(a) (d)中任一种的核酸(a)具有序列号1或19的碱基序列的核酸、(b)编码具有序列号2或20的氨基酸序列的蛋白质的核酸、(c)与所述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸、(d)在严格的条件下与所述(a)的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸。
2.—种核酸，其含有下述(e) (h)中任一种的核酸，并且其与具有序列号1的碱基序列的核酸具有70%以上的序列同一性，并编码牵引丝蛋白，(e)具有序列号3、5、7、9、11、13、15或17的碱基序列的核酸、(f)编码具有序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白质的核酸、(g)与所述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸、(h)在严格的条件下与所述(e)的核酸的互补链杂交的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其与具有序列号1的碱基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。
4.一种核酸，其含有下述(i) (1)中任一种的核酸，并且其与具有序列号19的碱基序列的核酸具有70%以上的序列同一性，并编码牵引丝蛋白，⑴具有序列号2U3、25、27、29、31、33或35的碱基序列的核酸、(j)编码具有序列号22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白质的核酸、(k)与所述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸、(1)在严格的条件下与所述(i)的核酸的互补链杂交的核酸。
5.根据权利要求4所述的核酸，其与具有序列号19的碱基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。
6.由权利要求1 5任一项所述的核酸编码的蛋白质。
7.导入有权利要求1 5任一项所述的核酸的重组生物。
8.导入有权利要求1 5任一项所述的核酸的重组桑蚕。
9.由权利要求7所述的重组生物制作的蛋白质。
10.由权利要求8所述的重组桑蚕制作的蚕丝。
11.具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牵引丝蛋白， (m)序列号2或20的氨基酸序列、 (η)与所述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。
12.具有下述(ο)或(ρ)的氨基酸序列的牵引丝蛋白，(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且与序列号2的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列；(01)序列号4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列、(02)与所述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列、(P)具有下述(Pl)或(P》的氨基酸序列且与序列号20的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列；(Pl)序列号22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列、(p2)与所述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的牵引丝蛋白，其中，所述(ο)的氨基酸序列与序列号2的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性，所述(ρ)的氨基酸序列与序列号20的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性。
14.具有下式(1)所示的氨基酸序列或与式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7_X8] n (1)式中，m各自独立地表示0或1的整数、η表示1 10的整数、Xl表示序列号37 45 中的任一种氨基酸序列、Χ2表示序列号46 52中的任一种氨基酸序列、Χ3表示序列号 53 59中的任一种氨基酸序列、Χ4表示序列号49的氨基酸序列、)(5表示序列号60或61 的氨基酸序列、Χ6表示序列号62 64中的任一种氨基酸序列、Χ7表示序列号65 70中的任一种氨基酸序列、Χ8表示序列号71 81中的任一种氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供下述(a)～(d)中任一种的核酸(a)具有序列号1或19的碱基序列的核酸、(b)编码具有序列号2或20的氨基酸序列的蛋白质的核酸、(c)与上述(a)的核酸具有90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸、(d)在严格的条件下与上述(a)的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸。
文档编号C12N15/12GK102399786SQ20111026819
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月9日 优先权日2010年9月10日
发明者中垣雅雄, 王玉军, 赵天福 申请人:冈本株式会社