专利名称：抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术嵌合抗体领域，具体的说是抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体。
背景技术：
血小板GPIb a是一种血小板特异性膜糖蛋白，以GPIb_IX_V复合物的形式存在， 该复合物包含四个亚单位，GPIb a，GPIbP，GPIX和GPV，以2 4 2 I的比例组成。它们都是I型跨膜糖蛋白，包括胞外区，跨膜区和胞浆区。GPIba与GPIbP之间以二硫键的形式共价连接组成GPIb，GPIb与GPIX，GPV以非共价键的形式连接形成GPIb-1X-V复合物。 GPIba是该复合物中主要的配体结合亚单位。当血管受损时，血小板膜表面受体GPIb a在高剪切力条件下与血浆VWFAl结构域结合，同时VWF的A3结构域与血管损伤部位暴露的内皮下基质主要是胶原结合，从而在VWF的桥联作用下实现血小板的初始黏附。此外，VWF结合GPIb a后引发一系列血小板细胞内信号传递，最终使血小板整合素受体GPIIb/IIIa活化，引起血小板聚集，形成血栓。而动脉血栓引起的中风、心肌梗死等血栓栓塞性疾病是我国最常见的死亡病因之一，且其发病率仍在不断上升。目前临床应用的阿司匹林和氯噼格雷是第一代抗血小板药物，GPIIb/IIIa抑制剂为第二代抗血小板药物。虽然这些药物对于改善动脉血栓引起的血栓栓塞性疾病有着巨大的贡献，但是，仍然有相当一部分病人用了这类药物之后不能改善缺血性症状。另外，潜在的出血并发症也限 制了这些药物的应用。血小板黏附是动脉血栓形成的早期必经阶段，阻断GPIb α与VWF的结合，抑制血小板的初始黏附，被认为能够有效抑制血栓形成，并且能够降低出血倾向。Deckmyn等报道在狒狒股动脉狭窄血栓模型的体内实验中应用抗血小板GPIb α单克隆抗体6B4-Fab剂量为O. 6mg/kg 时可以明显减少单位时间内周期性血流减低发生的次数，还明显抑制血小板在I型胶原上的沉积(700-1000/s)。2mg/kg的6B4_Fab可以完全抑制周期性血流减低的发生,而无出血时间的延长。因此，抗GPIba单克隆抗体具有良好的抗血栓应用前景。
但是目前市面上的抗血小板GPIb α单克隆抗体大多还是鼠源性抗体，由于鼠源性抗体应用到人体后可能出现人抗鼠抗体反应，因此逐渐被人源化抗体所取代，这是单抗发展的趋势。发明内容
本发明的目的是提供一种人源化的抗血小板GPIb α单克隆抗体及其制备方法。
本发明提供的抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体，包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟重链，所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第 453 666位氨基酸残基，所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第I 452位氨基酸残基。
上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体为如下I)或2)所示蛋白质
I)由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有抗人血小板I吴糖蛋白Iba功能的由I)衍生的蛋白质。
上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体的编码基因为如下I) 3)中任一所述的基因
I)其核苷酸序列是序列表中的序列I ;
2)在严格条件下可与序列表中的序列I限定的DNA序列杂交且编码上述任一抗体的DNA分子；
3)与I)的基因具有90%以上同源性且编码上述任一抗体的DNA分子。
含有上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体编码基因的重组表达载体、试剂盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
附图是本发明嵌合抗体及其Fab片段体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集分析图。其中(A) (f)富血小板血浆与10μ g/ml chSZ2 ； (g)富血小板血浆与10 μ g/ml鼠源 SZ2 ； (h)富血小板血浆与10 μ g/ml人IgG(B) chSZ2Fab呈剂量依赖型抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(a至e代表O. 5,1,2, 5,10 μ g/ml chSZ2Fab片段).具体实施方式
下面结合附图，对本发明作进一步说明。
实施例1:抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体的获得
一、引物设计和合成，
实验中所涉及的引物除了试剂盒提供的以外,均为Invitrogen公司合成。
权利要求
1.抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体,包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟重链，其特征在于所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第453 666位氨基酸残基，所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第I 452位氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体，其特征在于所述嵌合抗体为由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列I。
5.含有权利要求3所述编码基因的重组表达载体或表达盒。
6.含有权利要求3所述编码基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求3所述编码基因的重组菌。
全文摘要
本发明公开了抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体，包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟重链，所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第453～666位氨基酸残基，所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第1～452位氨基酸残基。本发明还公开了所述嵌合抗体的制备方法及其浓度效果分析。
文档编号C12N1/21GK102993307SQ20111026669
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者费敏, 阮长耿, 杨剑峰 申请人:苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司, 苏州大学