专利名称：中国鸡痘病毒282e4弱毒株全基因组序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列及其应用。
背景技术：
鸡痘病毒(fowlpox virus, FPV)属痘病毒科禽痘病毒属，成熟病毒粒子呈砖型或椭球型，大小为280nmX330nm，表面呈桑椹样，是迄今为止所发现的动物病毒中体积最大、
结构最复杂的病毒之一。FPV作为痘病毒中禽痘病毒的代表，与其他痘病毒相比，基因组更为庞大，能容纳更多外源基因而不丧失其感染性；外源蛋白在宿主细胞内能被忠实表达，并进行必要的糖基化、羧基化等修饰；表达产物具有良好的免疫原性，可诱导机体产生长效的细胞免疫和体液免疫；严格的胞浆内复制，避免了病毒自身的基因及其所携带的外源基因重组入宿主细胞染色体的可能，消除了重组鸡痘病毒应用后的遗传威胁；宿主范围较窄，只能涵盖禽类， 而感染范围较宽，虽只表现为一过性感染(又称流产性感染)，却几乎涉及所有哺乳动物细胞，即有效感染哺乳动物细胞后表达早期基因、部分晚期基因并进行DNA的复制，但不能发育为具有感染性的成熟病毒粒子；作为预防或治疗性生物制剂的安全性和有效性已被大量的动物和人体试验证明。因此，FPV不仅能用于研发禽类基因工程活载体疫苗，而且可作为非复制型活载体用于包括人类在内的哺乳动物疾病的防治，是当前研究的一个热点。我国FPV282E4弱毒株可作为预防鸡痘的安全、有效疫苗，以其为载体制备的禽类和哺乳动物的基因工程活载体疫苗有着良好的应用前景，截至目前为止，还没有中国 FPV282E4弱毒株全基因组序列的报道，从而限制了对该毒株的进一步研究和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供中国鸡痘病毒 2E4弱毒株全基因组序列及其应用。为了实现本发明目的，本发明的中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列，其全基因组序列如SEQ ID No. 1所示，全长共308，8 个核苷酸，GC含量观.18%，含有313个预测的ORF。本发明的中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列可用于鸡痘病毒功能基因组学、新型病毒载体构建、新型鸡痘病毒预防性疫苗和快速诊断检测试剂，以及鸡痘病毒遗传变异规律及其致病、感染与免疫机制等研究。本发明提供一种鸡痘病毒载体穿梭质粒，其包括重组臂TKL和TKR、双向启动子PE/L、目的蛋白表达盒、抗性标记基因和复制起点ori，在所述双向启动子PE/L上下游分别具有多克隆位点MCSL和MCSR。前述的穿梭质粒，目的蛋白优选为报告蛋白，如绿色荧光蛋白 (GreenFluorescentProtein, GFP)，在所述报告蛋白表达盒两端均具有Ioxp序列。此外， 根据需要，也可将β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶(LUC)、氯霉素乙酰转移酶(Cat)等作为报告蛋白。另外，还可连入需要表达的目的蛋白，如用作疫苗的抗原、中和病毒的抗体以及细胞因子等。前述的穿梭质粒，所述目的蛋白表达盒的启动子为PL。前述的穿梭质粒，所述抗性标记基因为AMP。前述的穿梭质粒，重组臂TKL的核苷酸序列如SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示；重组臂TKR的核苷酸序列如SEQ IDNo. 5或SEQ IDNo. 6所示。本发明还提供前述穿梭质粒重组得到的重组表达载体。本发明还提供前含有前述穿梭质粒或前述重组表达载体的宿主。本发明进一步提供前述穿梭质粒在制备重组鸡痘病毒活载体疫苗中的应用。本发明提供的中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列，为进一步明晰我国鸡痘病毒弱毒株遗传衍化特征、全基因组背景提供了客观依据，为进一步研制开发新型鸡痘病毒预防性疫苗和快速诊断检测试剂提供了可靠数据资料，为深入研究鸡痘病毒遗传变异规律及其致病、感染与免疫机制奠定了坚实基础。
图 1 为本发明重组臂 TKR-610、TKR-1875 以及 TKL-357、TKL-852、TKL_U83 的 PCR
扩增结果。图2为本发明重组鸡痘病毒载体穿梭质粒构建流程图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中涉及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、连接、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版相关章节进行。本发明的中国鸡痘病毒弱毒株购自中国兽医药品监察所。实施例1中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列的获得1鸡痘病毒的培养1. 1鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备1. 1. 1鸡胚的处理取9-11日龄SPF鸡胚两个，在无菌条件下取出放入平皿中，去头、四肢和内脏，剪成小块后用Hank' s液洗2次，每次约10ml。将小块移入IOml青霉素瓶内，用眼科剪将其剪成l-2mm大小的碎块，加20ml Hank' s液冲洗，静置2min，使组织块下沉，碎片仍在悬液内，然后吸去上清，依同法再冲洗2-3次。1. 1. 2 消化在沉淀中加入4倍量0. 25%胰酶溶液(约2. 5ml)，振荡混勻后，置37°C水浴中感作30min，每IOml轻轻摇动一次。至20min时用力摇动l_2min，此时有大量细胞游离，液体变混。30min时取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用Hank' s液轻轻洗两次，除去残留胰酶。
1. 1. 3分散细胞将组织块移入IOOml培养瓶中，加入IOml MEM原液，用大口吸管反复吹打数次，使细胞游离，移入以滴管反复吹吸数次，分散细胞。细胞悬液经4层纱布过滤，滤出的悬液以 600rpm离心5-lOmin，吸除上清，加入IOml MEM完全培养液，并用吸管吹打数次，直至沉淀分散均勻形成细胞悬液。应避免产生气泡，以免影响细胞计数。1.1. 4细胞计数取上述细胞悬液0.5ml，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数。计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算。将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数。
细胞总数/ml = 4細，絲 χ 10000 χ稀释倍数1. 1.5分瓶培养根据细胞计数结果，用MEM安全培养液将细胞稀释为3 XlO5Ail，按每瓶8ml分装于培养瓶中，置37°C 5% CO2培养箱中培养。鸡胚成纤维细胞在1 池贴壁，数小时后开始生长，24-4 长成单层。1. 1. 6消化传代鸡胚成纤维细胞在培养瓶中长成单层后，在无菌的条件下将培养瓶内的MEM完全培养液倾出，用Iml 0. 25%胰酶溶液洗一次，然后加0. 5ml胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并除残留胰酶，每个培养瓶中加18ml MEM完全培养液，分装于六孔的细胞培养板中(每孔:3ml)或培养瓶中(每瓶9ml)，置37°C 5% CO2培养箱中培养。1.2FPV毒价测定制备CEF单层细胞，以IO6个细胞/mL覆盖于6孔细胞培养板(孔径3. 5cm， 6X 30mm)，每孔2mL，培养至细胞长成融合单层。吸去培养液，以无血清MEM洗细胞2次， 将FPV病毒液以无血清MEM培养液按10_4 10_8递进10倍比稀释，然后每孔接病毒稀释液500 μ L，设一孔作空白细胞对照，37°C 5% CO2培养箱中吸附1. 5 浊。补加含2%小牛血清(FCS)MEM维持液2mL培养72 96h，吸弃培养上清，补加含1 %甲基纤维素和4% FCS的2XMEM作为维持液，370C 60 80%湿度5% CO2继续培养M 48h，吸弃培养液，用 PBS洗两次，在倒置显微镜下直接检查蚀斑数，并计算病毒原液中的病毒滴度。或在室温下
甲醛固定15min，自来水冲洗，0. 结晶紫染色5min，自来水冲洗后在倒置显微镜下观察病毒空斑数，按如下公式计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque forming units, PFU)。病毒滴度(PFU/mL)=病毒空斑数X稀释倍数/接种量。FPV病毒最佳接种细胞量的确定所需MOI数X细胞数/病毒滴度(PFU/mL)=所需接种量(mL)1.3接种FPV病毒制备CEF单层细胞，以IO6AiL细胞覆盖于6孔细胞培养板(孔径3. 5cm, 6 X 30mm)， 每孔2mL，培养至细胞长成融合单层。吸去培养液，以无血清MEM洗细胞2次，用无血清MEM 按IMOI稀释FPV并感染单层CEF细胞，37°C 5% CO2培养箱中吸附1. 5 2h，吸弃病毒稀释液，补加含2% FCS的MEM维持液2mL培养72 96h，至80%细胞出现变圆、脱落病变时将细胞培养板从细胞培养箱中取出后待用。2鸡痘病毒基因组的提取用Axyft^p基因组DNA提取试剂盒(AxyGen公司)提取。具体步骤为取产生80%以上病变的6孔板培养细胞，尽可能丢掉上清液，加入 350 μ L PBS到每孔中，室温静置lmin，用吸头来回吸注几次，转移350 μ L勻浆至2mL离心管，加入0.8 μ LRNaseA，漩涡振荡15s，室温静置lmin。加入150 μ L缓冲液C-L和8 μ L蛋白酶K，立即漩涡振荡Imin混合均勻，短暂离心后，将离心管置56°C水浴lOmin。加入350 μ L 缓冲液P-D，漩涡振荡30s混合均勻，12000 Xg离心IOminJf DNA制备管置于2mL离心管中，将上步的混合液移至制备管中，12000 Xg离心lmin。弃滤液，将制备管置回原来的2mL 离心管中，加入500 μ L缓冲液Wl，12000 Xg离心lmin。弃滤液，将制备管置回原来的2mL 离心管中，加入700 μ L缓冲液W2，12000 X g离心lmin,以同样的方法，用700 μ L缓冲液W2 再洗涤一次。弃滤液，将制备管置回原来的2mL离心管中，12000Xg离心lmin。将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入30 μ L洗脱液，室温静置lmin， 12000Xg离心Imin洗脱DNA。(上述缓冲液均为试剂盒中配套产品)3基因组的定量和检测用DNAnoDrop 2000/200c检测仪(Therme公司)测定核酸浓度，提取的基因组浓度测定结果为154. 2^g/yL，用1 %琼脂糖凝胶电泳上样2 μ L检测提取的基因组，检测结果表明符合测序要求。4基因组测序采用Solexa技术进行测序，结果用从头测序(de novo sequencing)进行分析和组装，测序结果如SEQ ID No. 1所示，测序工作由深圳华大基因科技有限公司完成。实施例2新型鸡痘病毒载体穿梭质粒的构建及应用由于鸡痘病毒(FPV)基因组庞大，直接操作基因组DNA有很大困难，因此需要首先构建FPV表达载体，然后通过同源重组的方法得到重组病毒。目前重组鸡痘病毒穿梭表达载体的构建多以TK基因的侧翼序列作为重组臂。另外，同源序列的长度与重组鸡痘病毒 (rFPV)的产生效率直接相关。前期研究表明，当同源序列长度从0.731Λ延长到4.51Λ时， 其同源重组率可从0. 073%线性增长到0. 62%。在FPV全基因组背景未知的情况下，要获得TK基因两侧的序列很难，从而为rFPV的构建造成了一定困难，也从一定程度上限制了重组鸡痘病毒载体疫苗的发展。而FPV全基因组序列的获得使构建高重组效率的rFPV成为可能。通过查询FPV全基因组，可很容易获知TK基因两侧的序列，然后通过基因克隆或全基因组合成的方法就可以得到同源重组序列，并可根据左右臂长度的不同，来确定最合适的重组臂。本实施例即是利用已知的序列，通过设计引物，克隆TK基因的侧翼序列，获得了 3 个左臂(TKL)和2个右臂(TKR)，以此为基础，构建了 6个鸡痘病毒穿梭表达载体，为后期重组鸡痘病毒的获得奠定了坚实基础。1引物的设计参考已测序的中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列，用DNAstar进行引物设计，上下游均添加合适的酶切位点，其中TK基因左侧(TKL)上游均添加I^c I酶切位点，下游均添加EcoRV、BamHI、XbaI ；TK基因右侧(TKR)上游均添加Bgl II酶切位点，下游均添加Spe I酶切位点，引物序列如表1所示表1用于重组臂PCR扩增的弓丨物序列
权利要求
1.中国鸡痘病毒弱毒株全基因组序列，其特征在于，其全基因组序列如SEQID No. 1所示。
2.权利要求1所述的基因组序列在构建鸡痘病毒载体以及制备鸡痘病毒预防性疫苗和诊断检测试剂中的应用。
3.中国鸡痘病毒载体穿梭质粒，其包括重组臂TKL和TKR、双向启动子PE/L、 目的蛋白表达盒、抗性标记基因和复制起点ori，在所述双向启动子PE/L上下游分别具有多克隆位点MCSL和MCSR。
4.如权利要求3所述的穿梭质粒，其特征在于，在所述目的蛋自表达盒两端均具有 Ioxp序列。
5.如权利要求3或4所述的穿梭质粒，其特征在于，所述目的蛋白表达盒的启动子为PL。
6.如权利要求3或4所述的穿梭质粒，其特征在于，所述抗性标记基因为AMP。
7.如权利要求3或4所述的穿梭质粒，其特征在于，重组臂TKL的核苷酸序列如SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示；重组臂TKR的核苷酸序列如SEQ ID No. 5或 SEQ IDNo. 6 所示。
8.与权利要求3 7任一项所述穿梭质粒重组得到的重组表达载体。
9.含有权利要求3 7任一项所述穿梭质粒或权利要求8所述重组表达载体的宿主。
10.权利要求3 7任一项所述的穿梭质粒在制备重组鸡痘病毒活载体疫苗中的应用。
全文摘要
本发明首次提供了中国鸡痘病毒282E4弱毒株全基因组序列，其全基因组序列如SEQ IDNo.1所示。所述序列可用于鸡痘病毒功能基因组学、新型病毒载体构建、鸡痘病毒预防性疫苗等研究。该序列为进一步明晰我国鸡痘病毒282E4弱毒株遗传衍化特征、全基因组背景提供了客观依据，为进一步研制开发新型鸡痘病毒预防性疫苗和快速诊断检测试剂提供了可靠数据资料，为深入研究鸡痘病毒遗传变异规律及其致病、感染与免疫机制奠定了坚实基础。
文档编号C12N1/15GK102321637SQ20111026788
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者刘存霞, 孙丹丹, 朱娜, 李昌, 李沂, 李霄, 杜寿文, 王茂鹏, 田明尧, 秦艳青, 金宁一, 金扩世, 鲁会军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所