专利名称：罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒基因组学技术领域，具体涉及罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序列及其应用。
背景技术：
罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii DeMan, 1879 ),又称淡水长臂大虾， 属于沼虾属(Macrobrachium )，是我国淡水甲壳类动物主要养殖品种。根据联合国粮农组织(FAO )于2009 的统计资，罗氏沼虾的全球养殖总产 2008 达到了的207749 吨，其中亚洲产则为127627吨，占全球产 98%，中国是全球最大的养殖国。病毒是罗氏沼虾育苗和养殖过程中的主要病原，暴发于2009年和2010年的罗氏沼虾幼体综合症(Macrobrachium rosenbergii larval Syndrome，MRLS)，造成罗氏沼虾在幼体期出现大量死亡，特别是在幼体6-9日龄死亡尤为严重，死亡率一般为80-90%，严重的达到100%，涉及我国主要罗氏沼虾育苗区域，给罗氏沼虾育苗产业造成的经济损失无法估量。经研究发现其主要病原为一种新的双顺反子病毒，暂命名为罗氏沼虾双顺反子病毒 (Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus, MRDV), MRDV 为单正链 RNA 病毒，归为双顺反子病毒科，被发现以来，因无该病毒基因组相关信息，更缺少检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的诊断和预防工作，因此该病毒基因组全序列的解析及其相关应用显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序列及其应用的技术方案，本发明为检测MRDV、研究MRDV感染途径等目的奠定可靠的基础。所述的一种分离的核酸分子，其特征在于所述的核酸分子含有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其反义序列。所述的一种分离的核酸分子，其特征在于所述的核酸分子为DNA或RNA。所述的一种分离的核酸分子用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、探针或
试齐U盒。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的150-10300个核苷酸。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的300-10300个核苷酸。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的1000-10300个核苷酸。所述的一种引物，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中15-100 个连续核苷酸。所述的一种探针，其特征在于含有SEQ ID N0:1所示序列或其反义序列中25-7000 个连续核苷酸。所述的一种试剂盒，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中 50-500个连续核苷酸。本发明对罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组进行测序，得到了罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组全序列，并且本发明利用该全序列用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、探针或试剂盒，为检测MRDV、研究MRDV感染途径等目的奠定可靠的基础。
具体实施例方式本发明中的核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的基因组全序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。第一方面，本发明提供了一核酸，该核酸含有在SEQ ID N0:1所示的罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列有序列相同性的序列的核酸。根据具体的序列，序列相同性的程度宜大于50%(例如 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%或更高)。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些片段应包含诸序列中至少η个连续的氨基酸，并且根据具体的序列，η为10或更高(例如，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，60，75，100 或更高)。较佳地，该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒基因组特有的，换言之在其他生物体的基因组中并不存在。更佳地，该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒毒株的基因组特有的。本发明还提供了与本文所提供的核酸发生杂交的核酸。杂交条件如本文中所述。本发明还提供了一核酸，该核酸包含与上述序列互补的序列(例如，用于反义、用于探针、或用于扩增引物)。当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从DNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物等)。术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。应理解，因为SEQ ID NO: 1代表了罗氏沼虾双顺反子病毒的完整基因组。本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体、测序载体、克隆载体等)以及用这些载体转化的宿主细胞。
第二方面，本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有本文所示的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列。还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的序列的蛋白。根据具体的序列，序列相同性程度宜大于50% (例如6096，70%, 80%, 90%, 95%, 99%或更高)。序列相同性用如上所述的方法确定。这些同源蛋白包括本文所示的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中所编码的突变体和等位基因变体。本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有序列表中所公开的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少η个连续的氨基酸，并且根据具体的序列，η为7或更高(例如，8，10，12，14，16，18，20或更高)。这些片段宜包含该序列的表位。本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。第三方面，本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、计算机存储器、计算机存储介质(如软盘、硬盘、CD-ROM等)和/或计算机数据库。较佳地，它含有本文列出的一种或多种罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。这可用于分析本文所列出罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。例如，可用于检索以鉴别序列中的开放阅读框(ORF)或编码序列。第四方面，本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法，它包括步骤检索本文所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地，本发明提供了此处所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋白质编码序列中的用途。开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。 用于分析的典型算法或程序包括0RFFINDER (NCBI), GENMARK[Borodovsky &Mcininth (1993)Computers Chem 17:122-133〕和GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res 26:544-548]。对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤检索此处所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中的起始密码子和检索上游序列中的处于读框中终止密码子。中间的密码子就代表了推定的蛋白编码序列。通常，应检索一个序列中6种可能的读框。用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达，以获得蛋白。该蛋白可用于产生抗体，而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛选罗氏沼虾双顺反子病毒，以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。此外，一旦鉴别出ORF或蛋白编码序列，那么就可将该序列与序列数据库进行比较。序列分析工具可在NCB工(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)处找到，例如 BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx，和 tBLASTx 算法[还可参见 Altschul 等人.(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用于比较的合适数据库包括非冗余GenBank，EMBL, DDBJ和PDB序列，以及非冗余GenBank CDS翻译物， PDB, SwissProt, Spupdate和P^序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测，例如基于Esposti等人的统计学研究的算法[“膜蛋白亲水性的关键评价” (Critical evaluation of the hydropathy ofmembrane proteins) (1990)Eur J Biochem 190 207-219]。疏水区代表了潜在的跨膜区或疏水性前导序列，这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标
ο类似地，可用PSORT算法(http://www. psort. nibb. ac. jp)来预测跨膜区或前导序列，以及用MOTIFS程序来预测功能区(GCG Wisconsin&PROSITE)。本发明还提供了一种核酸，该核酸含有本文所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中的开放阅读框或蛋白编码序列。此外，基于本发明所提供的基因组序列，还提供了若干种蛋白质，该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO 1中第392-6589位的ORF就编码一个长度为2065个氨基酸的病毒蛋白酶和 RNA 聚合酶前体蛋白(pre-proprotein) (SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO 1 中第 6961-10053 位的ORF就编码一个长度为1030个氨基酸的病毒衣壳前体蛋白(pre-proprotein) (SEQ ID NO :3)。第五方面，本发明提供了结合这些蛋白的抗体。它们可能是多克隆的或单克隆的， 可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。本发明的抗体可以以各种不同方式使用，例如用于证实蛋白质的表达，或用于证实蛋白质表达的场所。例如，标记的抗体(如荧光标记以用于FACS(流式细胞分选仪))可以与完整的病毒一起孵育，而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。第六方面，本发明提供了各种方法。本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法，该方法包括步骤在诱导蛋白表达的条件下，培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成(至少部分合成)核苷酸。本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤(a)在适合形成抗体一抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合物。第七方面，本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法， 这些抗原或多肽或蛋白质是对罗氏沼虾双顺反子病毒的任何毒种或毒株特异性的，较佳地是对罗氏沼虾双顺反子病毒毒株特异性的，但更佳地是对罗氏沼虾双顺反子病毒特异的。 该方法包括步骤(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下，使本发明抗原或多肽或蛋白质与生物样品接触；和(b)检测所述复合物。方法综述
本发明提供了罗氏沼虾双顺反子病毒MRDV核苷酸序列、和其所编码的氨基酸序列。利用这些所公开的序列，可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。蛋白质还可化学合成。表达载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肤可用于产生抗体以检测MRDV蛋白。 而且，宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外，利用这些序列，人们可检索以鉴定开放读框(ORF)和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及用作疫苗组份。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。免疫诊断试验
本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒抗原或开发的重组抗原，可用来制备相应的实验动物抗体，该类抗体可用于免疫试验来检测临床罗氏沼虾样品的病毒抗原水平。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。核酸杂交
“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种结合的因素包括溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt’ s试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。核酸探针试验
采用本发明的核酸探针的方法(如PCR、分支DNA探针试验或印迹技术)能确定cDNA 或mRNA的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双链复合物，则称探针与本发明的序列“杂交”。核酸探针将与本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列(包括有义和反义链) 杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列，但是天然的罗氏沼虾双顺反子病毒序列是较佳的，因为它是实际存在于细胞中的序列。mRNA代表一种编码序列，因此探针应与该编码序列互补；单链cDNA与mRNA互补，因此cDNA探针应与非编码序列互补。探针的确切长度和序列将取决于杂交条件，如温度、盐浓度等。例如，对于诊断应用，根据分析物序列的复杂程度，核酸探针通常含有至少10-20个核苷酸，较佳的15-25个， 更佳的至少30个核苷酸，但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度，以便和模板形成足够稳定的杂交复合物。探针可用合成方法产生，例如Matteucci等人[J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 :3185]的方法或Urdea等人[Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 :7461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用来增加体内半衰期，改变RNA亲和力，增加核酸酶抗性等「例如参见Agrawal和工yer (1995) CurrOpin Biotechnol 6:12-19 ;Agrawal (1996) T 工 BTECH14:376-387]；还可采用类似物如肤核酸[例如参见 Corey (1997) T 工 BTECH15 2^-2 ;Buchardt 等人(1993) TIBTECH 11:384-386]。另外，聚合酶链反应(PCR)是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在 Mullis 等人[Meth. Enzymol. (1987) 155 3；35_350]；美国专利 4，683，195 和 4，683， 202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与
7扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。这些序列通常侧接所需的罗氏沼虾双顺反子病毒序列。利用最初的靶核酸作为模板，热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚合酶产生临界量的靶核酸后，它们可用较传统的方法(如Southern印迹)来检测。当采用 Southern印迹方法时，标记的探针将与罗氏沼虾双顺反子病毒序列(如其互补序列)杂交。另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人〔同上〕描述的传统印迹技术来检测。用凝胶电泳可纯化井分离利用聚合酶从mRNA产生的mRNA或cDNA。然后，将凝胶上的核酸印迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触，然后洗涤除去所有未杂交的探针。然后，检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。基因组序列的应用
基于对罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列的测定，可以了解与该病毒增殖及重要调控功能有关的基因结构和功能，找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点，寻找病毒致病甚至致死基因。一种应用方法是，用罗氏沼虾双顺反子病毒感染罗氏沼虾幼体，建立cDNA文库。 用双向末端法测定cDNA克隆，或直接对MRDV cDNA的文库用PCR扩增的方法进行序列测定。 基于本发明所提供的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组序列，可以大大方便引物的设计以及克隆的进程。另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针，来检测样品中是否存在罗氏沼虾双顺反子病毒或其遗传物质。对于探针而言，这种检测方法包括步骤 将DNA样品与本发明的探针接触，
观察是否形成DNA-探针复合物，形成了复合物就表示样品中存在罗氏沼虾双顺反子病毒或遗传物质。对于引物而言，这种检测方法包括步骤 用本发明的特异性引物，对样品进行PCR反应，
观察是否扩增产生了特异性的扩增产物，产生了特异性扩增产物就表示样品中存在罗氏沼虾双顺反子病毒或遗传物质。在本发明的一个实例中，罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序列是通过如下方法获得的，该方法包括步骤
1.分离纯化MRDV病毒，获取高纯度RNA样品。2.以此RNA样品为模板，以带有锚定序列的随机引物进行反转录反应，以合成单链cDNA。继续以此cDNA为模板，利用锚定序列引物，在Taq和De印Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增，并将扩增产物克隆入T载体，进行序列测定，获得大部分病毒序列
3.将得到的序列输入计算机，利用软件(如hnerpeace软件)进行拼接，再经后期工作得到完整的病毒基因组全序列。经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上获得了如SEQ ID NO 1 所示的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 病毒RNA的提取
取罗氏沼虾双顺反子病毒株CN-NTH感染的罗氏沼虾幼体，进行组织研磨，以体积比1 10加PBS缓冲液，超声破碎3-5秒，将细胞破碎。4°C 6000rpm离心30min后取上清液，用 0. 22um滤膜过滤除菌，再进行蔗糖/甘油非连续密度梯度离心，获得高纯度MRDV病毒，用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。逆转录PCR (RT-PCR)
设计并合成引物上5，-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3’ (SEQ ID NO :4)。取前述制备的RNA病毒5uL置于200 u L的PCR扩增专用小管中，加入IOOpmol的引物1，置于 65°C变性IOmin后，立即置于冰上，加入IOX逆转录缓冲液2 uL, 1 mmol/L 4XdNTP, 20U RNasin,禾口 50U Expand Reverse Transcriptase，力口水至终体积 20 u L。混勾后 42 "0 育Ih0PCR 扩增
设计并合成以下引物2。引物 2 :5，-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC -3，(SEQ ID NO :5)。取上述逆转录产物5uL置于200 u L的PCR扩增专用小管内，加入10 X PCR缓冲液 2 u L, 350 nmol 4 X dNTP, 700nmol 引物 2，8U 含 De印 Vent 的 Taq DNA 聚合酶， 混勻后置PCR仪进行扩增，循环参数95°C 3min 1个循环，94°C 30s, 54°C 30s, 68°C 3min 40个循环。反应产物取50uL于1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将大小为l_2Kb的片段割下回收纯化。连接反应
按如下条件与PMD20-T质粒讲行连接
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其特征在于所述的核酸分子含有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或其反义序列。
2.如权利要求1所述的一种分离的核酸分子，其特征在于所述的核酸分子为DNA或RNA。
3.如权利要求1所述的一种分离的核酸分子用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、探针或试剂盒。
4.一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列。
5.如权利要求4所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的150-10300个核苷酸。
6.如权利要求4所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的300-10300个核苷酸。
7.如权利要求4所述的一种分离的DNA分子，其特征在于含有SEQID NO: 1所示序列或其反义序列中连续的1000-10300个核苷酸。
8.一种引物，其特征在于含有SEQ ID N0:1所示序列或其反义序列中15-100个连续核苷酸。
9.一种探针，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中25-7000个连续核苷酸。
10.一种试剂盒，其特征在于含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反义序列中50-500个连续核苷酸。
全文摘要
罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列及其应用，属于病毒基因组学技术领域。本发明提供了罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列如SEQIDNO:1所示，并且本发明提供了罗氏沼虾双顺反子病毒特异性的引物、探针或试剂盒。本发明为检测MRDV、研究MRDV感染途径等目的奠定可靠的基础。
文档编号C12Q1/70GK102352366SQ20111029648
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 曹铮, 沈锦玉, 潘晓艺, 石正丽, 郝贵杰 申请人:浙江省淡水水产研究所