专利名称：一种快速鉴定水稻直立穗的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速鉴定水稻直立穗的方法，属于农业生物技术工程技术领域，专用于含直立穗基因qpe9-l的水稻品种的鉴定和选育。背景技术：
水稻品种产量潜力的提高，归功于株型的改良。穗型是水稻理想株型研究的重要内容。 杨守仁等在20世纪80年代初提出北方粳稻“短枝立叶，大穗直穗”的株型模式；即要求培育直立穗型粳稻品种。在粳稻育种中，由弯曲穗型到直立穗型是十分重要的株型转变。众所周知，历史上栽培的水稻品种穗型几乎都是弯曲穗型，自第一个大面积种植直立穗型品种辽粳5号育成后，直立穗型品种层出不穷，从长江流域到东北稻区都有直立穗型品种的分布。直立穗型品种普遍表现出较高的生物产量、干物质生产速率和产量潜力。直立穗型品种的培育和大面积应用，可认为是继矮化育种和杂种优势利用获得成功以来，我国水稻育种史上的第三个里程碑。因此直立穗型品种的选育也越来越受育种家们的重视。在直立穗育种中，十分关键的问题是对直立穗性状的准确鉴定，传统的鉴定方法是在水稻成熟后对稻穗进行观察鉴定。由于直立穗基因在不同的遗传背景下表型差异较大，这种鉴定方法存在一定的局限性，加上直立穗的植株仅仅只占分离群体的1/4，传统的鉴定方法也浪费了大量人力、物力、材料。因此，如何准确、快速、简单地对直立穗进行鉴定是提高直立穗育种效率的重要保证。随着控制水稻直立穗基因的克隆，可以利用基因功能标记进行辅助选择加速直立穗基因在生产上的应用。开发成本低廉且简便实用的基因功能标记是开展水稻分子标记辅助选择育种的基础和前提。直立穗基因的功能已经明确，由于直立穗在qPE9_l的第5外显子缺失了 637 个核苷酸并有12个核苷酸的插入，突变后形成一个蛋白质翻译终止密码子，造成 仅编码了 195个氨基酸，缺失了 C端231个氨基酸。本研究根据水稻直立穗基因的 DNA序列差异设计了基于PCR的功能标记，利用该标记对水稻品种资源材料进行了分析验证。并对直立穗分离群体进行鉴定，利用该方法可以快速、准确的鉴定出直立穗品种和单株。
发明内容
技术问题本发明的目的是开发水稻直立穗控制基因的InDel标记，利用本研究开发的基于PCR的经济实用型标记，可以快速准确地对直立穗控制基因qpe9_l进行基因型选择，主要用于基因的高效分子育种。技术方案
种快速鉴定水稻直立穗的方法，其特征在于用1对特异扩增水稻直立穗控制基因 qpe9~l的PCR分子标记引物InDel_E5，其序列为 InDel-E5-F TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT InDel-E5-R :GGCTCCATATCTTCACGGTCTA
扩增水稻品种或分离群体的DNA，如果只能扩增出732bp的1条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的纯合体；如果只能扩增出1357bp的1条特征条带，说明该植株是不含有直立穗基因的纯合体，如果同时能扩增出732bp和1357bp的2条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的杂合体。有益效果
本发明所提供的鉴定方法，是基于分子生物学手段获得的基因功能标记，具有如下优
点·
(1)本发明的鉴定方法是基于基因标记的方法，因此可以在苗期进行选择，且不受环境和遗传材料背景的影响。(2)本发明的鉴定方法可用于基因的分子标记选择育种，并且可以区分 qpe9_l基因的杂合体。由于该方法可以进行基因型选择，可以降低育种成本，提高育种效率。四
图1是直立穗功能标记hDel-E5对不同的水稻品种的PCR扩增后在1%的琼脂糖胶电泳结果(M为DNA ladder, DL2000 ； 1- 为明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳34、盐稻5 号、苏粳5号、泗稻8号、泗稻10号、农垦57、农垦58、广陵、武育粳3号、武运粳23号、南粳 45、徐稻3号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳1号、连粳7号、嘉花1号、辽粳5、沈农 265)
图2是直立穗功能标记hDel-E5对F2群体中不同单株PCR扩增后在1%的琼脂糖胶电泳结果(M为DNA ladder, DL2000 ； 1-24为弯穗品种农垦57与直立穗品种南粳45的F2中的部分单株)
五、具体实施方法
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。(一)快速鉴定直立穗基因qPe9-l的基因型分子标记的获得 (1)供试材料
试验材料为生产上的推广品种，弯穗品种包括明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳 34、盐稻5号、苏粳5号、泗稻8号、泗稻10号、农垦57 ；直立穗品种包括武育粳3号、武运粳23号、南粳45、徐稻3号、盐稻8号、扬辐粳7号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳 1号、连粳7号、嘉花1号、辽粳5、沈农沈5。(2)水稻直立穗qpe9_l基因标记的获得
直立穗品种和弯曲穗相比在qPE9_l第5外显子缺失了 637个核苷酸并有12个核苷酸的插入，突变后形成一个蛋白质翻译终止密码子，造成仅编码了 195个氨基酸，缺失了 C端231个氨基酸。根据其缺失位置两侧序列，利用软件Premier 5设计引物序列，hDel-E5 -For 为 5' -TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT-3‘ ； hDel_E5-Rev 为 5' -GGCTCCATATCTTCACGGTCTA-3‘。对含有直立穗基因 ？⑷-纟的品种DNA, 能够扩增出 733 bp的片段，而不带 76^-7的品种DNA扩增出1357bp片段。(3) DNA 提取
在水稻分蘖期或孕穗期取1克左右水稻叶片，利用SDS方法提取DNA。DNA提取参照DelIapporta等(1983)的方法，具体步骤如下
①取200-300 mg新鲜水稻叶片(_20°C保存的叶片)，在_20°C预冷研钵中用液氮研磨成粉末。
②转移到1. 5 ml离心管中。③加入600ul SDS提取液摇勻，65°C，温浴30 min，振荡3-4次。④加入1/4体积(约100 ul) KAc，摇勻。⑤加入1/2体积(约300-400 ul)的氯仿异戊醇(体积比Μ: 1)，振荡器上充分摇勻(120rpm, 30min)。⑥室温下6000-8000rpm离心15min，取上清。⑦加入2倍体积(700ul左右)_20°C预冷的无水乙醇、摇勻，一 20°C自由沉淀20 min。⑧室温下12000rpm离心6 min,弃上清，沉淀用等体积000 ul左右)70%乙醇洗涤 IOmin0⑨弃70%乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200 ul TE (1/10), 4°C保存备用。用0. 8% 的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。(4) PCR反应及电泳检测
PCR扩增反应体系为模板DNA (约15 ng μ Γ1) 2 μ L，引物(4 pmol μ Γ1) 2 μ L， IOX 缓冲液(25 mmol U1) 2 μ L,MgC12 (25 mmol L-1) 1. 2 μ L, dNTP (2.5 mmol 1^)0.4 μ L，Taq DNA聚合酶(5 U μ Γ1) 0. 2 yL，灭菌双蒸水12.2 Ml,反应体系为20 μ L。在 Eppendorf PCR 仪上进行扩增，反应条件为:(1)94°C 预变性 5 min ； (2)94°C，1 min ； 56 °C, 45 s ；72°C,1 min ；共；35个循环.(3) 72°C再延伸10 min。反应产物在1 %的琼脂糖上进行分离电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外凝胶成像仪上观察并照相。(二)对推广的水稻品种中直立穗的鉴定分析
水稻生产推广的品种中明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳34、盐稻5号、苏粳5号、 泗稻8号、泗稻10号、农垦57、农垦58、广陵香糯是典型的弯穗品种；而武育粳3号、武运粳 23号、南粳45、徐稻3号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳1号、连粳7号、嘉花1号、 辽粳5、沈农265是典型的直立穗品种。提取这些品种的DNA，利用hDel_E5对这些材料进行PCR扩增结果见图1。可以看出所有的直立穗品种都能够扩增出732 bp的特征条带，其基因型为；所有的弯曲穗品种都能够扩增出1357bp的特征条带，其基因型为 qPE9~lqPE9~l 。(三)对水稻直立穗分离群体中直立穗单株的鉴定分析
2009年以弯穗品种农垦57与直立穗品种南粳45配制杂交组合，同年于海南种植杂交种F1，于海南收获F2种子。2010年在南京种植F2群体。对F2群体进行挂牌取样，提取单株DNA，利用InDel-E5对F2群体进行PCR扩增结果见图2，结合成熟后穗部性状的调查结果发现所有扩增出732 bp特征条带的单株都表现为直立穗，而扩增出1357bp的特征条带或者732 bp和1357bp特征条带的单株都表现出弯穗性状。
权利要求
1. 一种快速鉴定水稻直立穗的方法，其特征在于用1对特异扩增水稻直立穗控制基因qpe9-l的PCR分子标记引物InDel_E5，其序列为 InDel-E5-F TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT InDel-E5-R :GGCTCCATATCTTCACGGTCTA扩增水稻品种或分离群体的DNA，如果只能扩增出732bp的1条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的纯合体；如果只能扩增出1357bp的1条特征条带，说明该植株是不含有直立穗基因的纯合体，如果同时能扩增出732bp和1357bp的2条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的杂合体。
全文摘要
本发明涉及一种快速鉴定水稻直立穗的方法，属于农业生物工程技术领域。根据水稻弯穗品种与直立穗品种在直立穗基因qpe9-1核酸序列上的差异，设计合成了1对插入-缺失标记(Insert/Delection)，InDel-E5。利用这对引物对待测水稻植株的DNA进行PCR扩增，分析标记的特征条带就能快速准确鉴定出水稻直立穗种质资源或育种群体中是否含有直立穗qpe9-1基因。这种鉴定方法还能区分qpe9-1基因的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对直立穗基因的选择效率，加速育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102304587SQ201110301570
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者仲维功, 朱金燕, 杨杰, 王军, 范方军 申请人:江苏省农业科学院