专利名称：Bt-06A晶体蛋白用于杀灭松材线虫的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害的生物防治技术，具体涉及一种Bt-06A晶体蛋白用于杀灭松材线虫的用途。
背景技术：
松材线虫，学名Bursaphelenchus xylophilus (Steiner&Buhrer),异名 Bursaphelenchus lignicolus Mamiya&Kiyohara,起源于北美大陆(Wingfield M J, 1983 ； Mamiya Y，1987)，目前该病虫害在世界上分布于北美、东北亚和欧洲部分地区(谢丙炎， 2009)。我国自1982年在南京中山陵首次发现该病虫害后，逐年扩大，县级发生区每隔5年翻一番，到2001年底，全国松材线虫县级发生区已达81个，而到2007年7月，已传播、扩散到我国12个省(区、市)的113个县(区、市)，累计致死松树5000多万株，至2009年，该病已经蔓延至我国14个省(自治区直辖市)的192个县级行政区、674个乡镇，2010年扩散到197个县级行政区，2010年发病的县级行政区为197个，到2011年有186个县级行政区，减少27个县级疫区，同时新增加16个疫区，已造成了重大的经济损失和生态破坏。目前，其致病机制尚不完全清楚，同时对松材线虫的防控仍然没有十分有效地途径，形势仍十分严峻。
多年来，对林木害虫的防治主要以化学防治手段为主，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了害虫的天敌及其他有益物种，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点，并且避免了上述一系列问题。因此生物防治技术成了人们关注的焦点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，其营养体呈杆状，后期在其一端或中央开始形成一个卵圆形的芽孢，亦称内生孢，其形成该过程中，在菌体内一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴孢晶体 (parasporal crystal)如 cry5、cry6、cryl2、cry 13 和 cryl4,对多种昆虫以及线虫、螨类和其他一些原生动物有特异杀虫活性，而Bt晶体蛋白对哺乳动物和其他脊椎动物没有毒性(Betz et al.，2000),基于此苏云金芽胞杆菌(Baclillus thuringiensis, Bt)晶体毒性蛋白被广泛的用于控制昆虫类害虫(Cannon, 1996 ；Schnepf et al. , 1998 ；Maagd et al., 1999)，目前Bt是转基因抗虫工程植物重要的基因来源，Bt已成为化学合成农药的有力替代品，转Bt晶体蛋白基因的植物的种植面积正在逐年增大，到2005年，转bt基因棉花的种植面积已经超过2600万公顷(James，2005)，目前，种植面积仍在继续扩大。
目前，G. Borgonie 等(G. Borgonie，M. Claeys, F. Leyns, G. Arnaut, D. De ffaele, A. V. Coomans, Effect of nematicidal Bacillus thuringiensis strains on free-livingnematodes.1. Light microscopic observations, species and biological stage specificity and identification of resistant mutants of Caenorhabditis elegans, Fundamental and Applied Nematology, Vol. 19(1996), pp. 391-398)证明 Bt晶体蛋白对模式线虫有致死作用，Xiang-Qian Li等(Xiang-Qian Li, Jun-Zhi Wei, Anderson Tan and Raffi V.Aroian。 Resistance to root-knot nematode in tomato roots expressing a nematicidal Bacillus thuringiensis crystal protein Plant Biotechnology Journal (2007) 5,pp. 455-46)记载了 Bt晶体蛋白对根结线虫具有抗性,但是，到目前为止，未见到该晶体蛋白在松材线虫的杀虫活性方面的报道，更未见过这方面的应用。发明内容
本发明根据上述领域的空白和需求，提供Bt_06A晶体蛋白的新用途，及一种杀灭松材线虫的新方法，以及这种方法涉及到的Bt-06A基因的超表达载体PB1-G0H-BT06A。为生物医药、微生物杀虫领域提供了很好的研究平台。
Bt-06A晶体蛋白用于杀灭松材线虫的用途，所述Bt_06A晶体蛋白的核苷酸序列如 Seq ID No.1 所示。
一种杀灭松材线虫的方法，其特征在于用能够表达Bt_06A晶体蛋白的转基因灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)饲喂松材线虫，使所述灰葡萄孢菌阳性转化子表达的 Bt-06A晶体蛋白在松材线虫体内发挥致死效应，所述Bt_06A晶体蛋白的核苷酸序列如Seq ID No.1 所示。
所述表达Bt_06A晶体蛋白的转基因灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),为通过转化有Bt-06A晶体蛋白表达载体的根癌农杆菌介导转化而得。
所述Bt-06A晶体蛋白表达载体指PB1-G0H-BT06A。
转化有Bt_06A晶体蛋白表达载体的转基因根癌农杆菌株或转基因灰葡萄孢菌菌株。
上述转基因根癌农杆菌株或转基因灰葡萄孢菌菌株在杀灭松材线虫中的应用。
本发明提供了 Bt_06A晶体在灭杀松材线虫上的新用途。通过实验证实，转化有 Bt-06A晶体蛋白的基因的灰霉菌饲喂松材线虫，大幅度增加了松材线虫的死亡率。本发明还提供了用于转化灰霉菌的Bt-06A晶体蛋白超表达载体。
图1 为 PB1-121 图谱
图2 为 Psilent-1 图谱
图3 为 PB1-GRH 图谱
图4为载体PB1-GR Cla I酶切检测
图5为载体PB1-GOH Kpn I酶切检测
图 6 为载体 PHD-0H-BT06A 和 PHD-OH-sGFP 酶切鉴定(M Maker trans 2K Ius, I PHD-0H-sGFP, 2 PHD-0H-BT05)
图7为转sGFP基因灰霉荧光检测
图8为转BT晶体蛋白6A基因灰霉PCR鉴定(M Maker Trans 2K plus, 1-10 :转化子，CK :未转基因灰霉)
图9为Southern杂交分析(CK :未转基因灰霉；1-1，2-1，7-1，8-1 :基因组DNA经EcoR I 酶切；1-2，2-2，7-2，8-2 :基因组 DNA 经 BamH I 酶切)
图10 为转 Bt_06A 基因灰霉 RT-PCR 分析(M Maker trans 2K plus ；2 :转化子 2 ； 7 :转化子7 ；8 :转化子8 ；CK :未转基因灰霉)具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明。
生物材料
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus) (USl)来自浙江，本实验室已进行多年的传代培养。
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),由中国科学院微生物研究所提供。
根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,商购。
农杆菌介导植物转化载体PB1-121(见图1)，已知载体，商购；Psilent-1 (见图 2)，为现有已知载体，由中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员惠赠。
申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。
仪器
Olympus实体显微镜、美国Polyscience冷冻离心机(9500)、恒温培养箱、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、移液器、匀浆器、离心管、枪头、 烧杯和pH计等。
试剂
Trizol Reagent, RT-PCR 反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司；
Southern杂交试剂盒购于ROCHE公司；
SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程有限公司；
Tag DNA聚合酶、DNA Marker 2000和克隆所用的大肠杆菌感受态细胞均购自全是金生物公司；
TA克隆试剂盒、限制性内切酶HindII1、Bgl I1、Xba I和Spe I等均购自Takara 生物公司。
TAE 缓冲液(50X) =Tris 碱 242g，冰醋酸 57.1ml,0. 5mol/L EDTA(ρΗ8· 0) 100ml。
土豆培养基(PDA)，用于培养灰葡萄孢菌称取IOOg去皮马铃薯，切碎，加500ml 蒸馏水，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯，补足500ml装入三角瓶，调整pH值为6. O。再称取 IOg葡萄糖，7. 5g琼脂粉，加入三角瓶后摇匀。121°C，20min高压蒸汽灭菌后倒入平板。
LB培养基，用于大肠杆菌蓝白斑筛选。酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
YEB培养基，分为固体和液体两种，用于农杆菌菌体的活化酵母粉0. 2g，甘露醇 5g, MgS04 · 7H20 0. lg, K2HP04 0. 25g, NaCl 0. 05g,琼脂 6g,溶于水，定容至 500ml (液体培养基不加琼脂)。
丽培养基，为扩大培养根癌农杆菌时所用的基本培养基，500ml的配方如下5ml K-buffer(pH7. 0) KH2P04 145g/L, K2HP04 200g/L ；10ml M-N NaCl 7. 5g/ L，MgS04. 7H2015g/L ;5ml葡萄糖20g/L (过滤灭菌后置于4 °C冰箱储存)；5ml FeS04O. 01g/L(过滤灭菌后置于 4 °C 冰箱储存)；0· 5ml CaC12. 2H20 lg/L ；2. 5ml Spore Elements(CuS04. 5H200. lg/L, ZnS04.7H20 0.lg/L, Na2Mo04.2H200. lg/L, MnS04. H20 0. lg/L, H3B030. lg/L) ；1. 25ml, NH4N03 20g/L ；470. 75ml 无菌水。
IM培养基，用于诱导培养根癌农杆菌，IL的配方0. 8ml1. 25M K-buffer,(将pH 调至4.9) ；20ml M-N NaCl 15g/L，MgS04. 7H20 30g/L ；lml CaCl2JH2O 2g/L ；10ml 50%甘油；2. 5ml NH4N0320g/L ；5ml Spore Elements ；40ml MES IM(将 pH 调至 5. 5)，用 NaOH 调节 pH值(过滤灭菌，4°C储藏)；10ml FeS04 O. 01g/L (过滤灭菌，4°C储藏)；10ml葡萄糖20g/ L(过滤灭菌)；2ml AS IOOmM(用无水乙醇溶解，放置于-20°C ) ;898. 7ml水。
共培养培养基(Co-1M)，用于灰葡萄孢菌和根 癌农杆菌进行共培养。配制时将诱导培养基頂中的葡萄糖用量减半。
卡那霉素溶于水中，配制浓度为10mg/ml,储存于_20°C ；
利福平溶于甲醇中，配制浓度为10mg/ml，储存于_20°C ；
潮霉素50mg/ml,避光储存于4°C ；
头孢霉素溶于水中，200mg/ml,储存于_20°C ；
MES 缓冲液(pH5. 5) MES 0. 15M, DTT 4Mm, EDTA 4mM。
实施例1 :构建农杆菌介导丝状真菌超表达的载体-PB1-GOH
农杆菌介植物遗传转化载体PB1-121 (图1)，原生质体转化丝状真菌RNAi载体 Psilent-1 (图2)(中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员惠赠)。PB1-121的毒区含有可以侵染植物和真菌所需表达的毒蛋白。
载体PB1-GOH的构建主要以PB1-121为骨架，对其T-DNA区加以改造，由上海生物工程公司合成了一段DNA序列(Seq ID No. 5)，其结构为Pme I,Kpn I酶切位点、构巢曲霉色氨酸启动子、多克隆位点、构巢曲霉色氨酸终止子、Cla I酶切位点(5，------3’ )参照Psilent-10首先对PB1-121进行改造，分别在PB1-121的T-DNA左边界(LB)的上下游设计引物(121-F、121-R)，上游引物为LB前端添加Cla I酶切位点，下游引物设计在Eamll05 I处，扩增到612bp的片段(Seq ID No. 6)，然后连接替代PB1-121中这两个酶切位点之间的片段，将其命名为PB1-G。将合成的基因在Pme I和ClaI酶切位点处连接到PB1-G上， 命名为PB1-G0，酶切鉴定如图4 ;在载体PB1-GO上添加潮霉素抗性基因作为选择标记。设计引物HYG-F和HYG-R (两端添加Kpn I酶切位点)以载体Psilent-1为模板扩增得到潮霉素抗性基因HPH，扩增产物连接于载体PMD-18T，酶切鉴定并测序确认插入到载体PB1-GO 的Kpn I酶切位点处，即获得载体PB1-GOH(图3)，酶切鉴定PB1-GOH(图5)阳性克隆并序确认，PB1-GOH序列见Seq ID No. 2，测序结果显示构建位置正确。
121-F CGGAATTCCG CTTTTGATTTATAAGG
121-R : TCGACAGCCTGTCACGGTTAAGCGAG
HYG-F :5’ -TGGTACCTAGACGTTAACTGATATTGAA-3>
HYG-R :5，-TGGTACCTAAACCCAGGGCTGGTGACGGA-3’
实施例2 :构建含目的基因的超表达载体
编码BT晶体蛋白6A的基因序列(Seq ID No.1)由上海生物工程技术公司合成，连接与PUC57载体上，BT晶体蛋白6A的基因以5’到3’方向连接在TOC57的Xba I和BamH I酶切位点处，Apa I位于PUC57载体BamH I下游(3’方向)。
将合成的BT晶体蛋白6A基因序列连接于PB1-GOH的Xba1、Apa I酶切位点处， 即得到含目的基因的超表达载体PB1-G0H-BT06A。sGFP基因作为转基因的对照基因，扩增自载体PCH-sGFP，两端添加HindII1、Xba I酶切位点，引物为GFP-F、GFP-R，PCR产物经克隆测序验证后，在Hindlll、Xba I位点处连接到载体PB1-G0H，得到载体PB1-G0H_sGFP。 PHD-0H-BT06A和PHD-OH-sGFP经酶切鉴定后(图6)，测序验证，PHD-0H-BT06A测序结果 (Seq ID No. 3)、PHD-OH-sGFP 测序结果(Seq ID No. 4)。GFP-F CCAAGCTTGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
GFP-R GCTCTAGAGCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT
实施例3 :灰霉的遗传转化
本实验以根癌农杆菌为介导，把能表达BT晶体蛋白6A的T-DNA片段(带有潮霉素抗性)转化到灰葡萄孢菌中，成功获得了灰霉转化子。
3.1农杆菌感受态制作
(I)挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于20ml液体YEB培养基中(含有50mg/L的利福平)，28°C，200rpm 培养 48h ；
(2)转接500 μ I摇培的ΕΗΑ105至50ml液体YEB (含有50mg/L的利福平)培养基中，28 °C，200rpm培养至0D600值为O. 6左右；
(3)将菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 离心 IOmin,弃上清；
(4)用50ml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 4500rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；
(5)用25ml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 4500rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；
(6)用IOml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 4500rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；
(7)用l_2ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，分装50 μ I/管，液氮中速冻后_80°C保存。3. 2电转法转化农杆菌
1.将I μ I PB1-G0H-BT06A和PBI_GOH_sGFP质粒分别加入到50 μ I农杆菌感受态细胞中，在离心管中混匀后转移到电击杯中，冰浴Imin ；
2.将电击杯放在适当的位置，按住电击按钮进行电击；
3.加500 μ I不含任何抗生素的YEB液体培养基，28°C，200rpm,振荡培养3h，活化菌体；
4.用灭菌枪头将菌液混匀，吸取60 μ I均匀涂于YEB固体培养基(卡那50mg/L和利福平50mg/L)上，28°C培养2天。
5.提取农杆菌质粒进行酶切鉴定或通过菌液PCR进行检测。
3. 3侵染菌液的制备
1.取转化后的农杆菌划线接种于YEB固体培养基上，28°C培养40h，至单菌落出现；
2.挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，280C，200rpm,振荡培养，0D600达到O. 6左右时终止；
3. 4500rpm离心IOmin,弃上清,沉淀物即为收集的菌体；
4.加入适量的頂培养基，用枪头吹吸使菌体悬浮。
3. 4用于农杆菌介导转化的灰葡萄孢菌菌丝的获得
用接种环涂断PDA固体培养基上的灰葡萄孢菌丝，接种于200mlPDA液体培养基中。25°C, 150rpm振荡培养2天。用灭菌的纱布过滤收集菌丝。在灭菌的研钵中进行研磨， 充分研碎后加入适量頂培养基。
3. 6共培养及筛选过程
1.共培养基经进行高压蒸汽灭菌，待冷却到50°C左右时加入MES，AS，glucose, FeS04，倒平板。等到培养基凝固后，在超净台中将与培养皿同等大小的灭菌微孔滤膜铺上， 赶尽气泡；
2.将灰葡萄孢菌菌丝碎片和诱导后的农杆菌按4 I混合，取400 μ I均匀涂到固体共培养培养基上；
3.避光，23 °C培养3天；
4.把培养基上的微孔滤膜揭下来，将反面铺到PDA培养基(头孢霉素300 μ g/mL、 潮霉素50 μ g/mL)上，置于25°C培养2天；
5.把微孔滤膜从培养基上揭下来,将培养皿放于25°C培养1-3天,长出的菌落即为能抗潮霉素的菌落；
6.挑取长出的抗潮霉素的单菌落，在PDA培养基(含头孢霉素)上进一步筛选。 为保证潮霉素的有效性，每板需要作阴性和阳性对照。
实施例4 :转基因灰霉的鉴定
灰霉DNA的提取
1.用液氮在无菌研钵中灰充分研磨灰霉菌丝；
2.取占1/5体积的研磨好的样品加入到2ml离心管中，然后向管中加入800 μ I FPCB (购于上海生工)，涡旋混匀，55°C水浴30min，不时摇动；
3.加入 800 μ I 酹氯仿(1:1)溶液,混勻；4°C 12000rpm 离心 IOmin ；
4.取上清液至新的2ml离心管,加入800 μ I氯仿；4°C 12000rpm离心IOmin ；
5.取上清液至新的1.5ml离心管，加入550 μ I异丙醇，混匀，室温静置lOmin， 4°C 12000rpm 离心 IOmin ；
6.弃上清，加入Iml 70%的乙醇漂洗,4°C 7500rpm离心5min ;
7.弃上清，待酒精挥干后，将DNA溶于20 μ I TE中，-20°C贮存；
8.1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的含量及质量。
经潮霉素筛选后，转sGFP基因的灰霉直接用荧光显微镜鉴定，转BT-06基因的灰霉，提取基因组DNA，分别进行PCR鉴定
(PCR 弓 I 物Bt-06-F A T G G C C A T C G A T AG C A A G A C T 和 Bt-06-R GGATCCTTATGGAGGGTTGTTG)、Southern 杂交鉴定
(探针引物Bt-06-SFATGGCCATCGATAGCAAGA 和 Bt-06-SR TCTACCTTGAMTCCTTGAT)，操作方法方法参见试剂盒说明书(Roche)。
挑取转化sGFP基因的转化子在波长488nm下进行荧光观查，同时以野生型菌株作对照，野生菌株无荧光，而转化sGFP基因的菌株发出绿色荧光(图7)。挑取具有潮霉素抗性的转BT-06A基因的转化子，提取DNA，进行PCR鉴定(图8)，随机挑取的10个转化子中有9个转化子经PCR扩增后得到相应大小的条带，并对PCR结果进行测序，确定BT-06A基因整合到灰霉中。
随机挑取PCR鉴定的转化子1、2、7、8进行southern杂交分析，分别以EcoRI和 BamHI对其基因组DNA进行酶切，以地高辛标记探针，southern结果显示(图9)，除转化子 I是双拷贝外，其余转化子均以单拷贝整合到灰霉基因组中。
实施例5 :转基因灰霉RT-PCR验证
对以单拷贝整合到灰霉中的3个转化子2、7、8进行表达水平检测，分别提取野生型灰霉和这3个转化子的总RNA并反转录为cDNA，进行RT-PCR分析(引物Bt_06-RTF ACATCTCTCGATCAGTTCTTAC 和 Bt-06-RTR TGGTCCTAACAAGAAGCTATAC)，结果表明(图 10)， Bt-06在3个转化子中均有表达。
实施例6 Bt-06A晶体蛋白对松材线虫的种群繁殖量的影响
取大约200条刚从灰霉上洗脱下来的松材线虫，接种于转sGFP基因和Bt_06A基因的灰霉上，以未转基因的灰霉为空白对照，每个处理3个重复2次平行，各处理的线虫置于25°C恒温培养箱培养7天后，统计各处理的线虫的数量及死亡线虫数量。
在各处理的灰霉上培养线虫，7天后收集线虫并统计，结果显示(表1)，未转基因灰霉和转sGFP基因的灰霉，其种群增长量和死亡线虫数量差异不显著，而与转Bt-06A基因的灰霉与未转基因灰霉和转sGFP基因的灰霉种群增长量和死亡量均差异显著，种群增长量小于而死亡量大于未转基因灰霉和转sGFP基因的灰霉。
表.1转基因灰霉对线虫数量和死亡虫量的影响
权利要求
1.Bt-06A晶体蛋白用于杀灭松材线虫的用途，所述Bt-06A晶体蛋白的核苷酸序列如Seq ID No.1 所示。
2.一种杀灭松材线虫的方法，其特征在于用能够表达Bt-06A晶体蛋白的转基因灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)饲喂松材线虫,使所述灰葡萄孢菌阳性转化子表达的Bt_06A晶体蛋白在松材线虫体内发挥致死效应，所述Bt_06A晶体蛋白的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，所述表达Bt-06A晶体蛋白的转基因灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),为通过转化有Bt_06A晶体蛋白表达载体的根癌农杆菌介导转化而得。
4.根据权利要求3所述的方法，所述Bt-06A晶体蛋白表达载体指PB1-G0H-BT06A。
5.转化有Bt-06A晶体蛋白表达载体PB1-G0H-BT06A的转基因根癌农杆菌株或转基因灰葡萄孢菌菌株。
6.转化有Bt-06A晶体蛋白表达载体PB1-G0H-BT06A的转基因根癌农杆菌株或转基因灰葡萄孢菌菌株在杀灭松材线虫中的应用。
7.一种Bt-06A晶体蛋白表达载体，为PHD-0H-BT06A。
全文摘要
本发明“Bt-06A晶体蛋白用于杀灭松材线虫的用途”，属于植物病害的生物防治技术。用能够表达Bt-06A晶体蛋白的转基因灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)饲喂松材线虫，使所述灰葡萄孢菌阳性转化子表达的Bt-06A晶体蛋白在松材线虫体内发挥致死效应。为生物医药、微生物杀虫领域提供了很好的研究平台。
文档编号C12R1/01GK103004765SQ20111030128
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者谢丙炎, 周梦溪, 王殿东, 潘洪玉, 陈国华 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所