专利名称：结核患者血清IgG抗体适配子及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物感染免疫和检验领域，涉及一种血清IgG (免疫球蛋白G)抗体的适配子及其制备方法，尤其涉及一种结核患者血清IgG抗体适配子及其制备方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染人体导致的结核病是一种严
重危害人民身体健康的慢性传染病。结核病是历史上患病率和死亡率最高的疾病之一。上
世纪50年代以来，结核病的流行在一定程度上得到了控制。我国是结核病高负担国家，国
务院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。因此，加强对结核病的研发力度，亟待
研制新型抗结核新药，以便对该病进行有效的治疗和预防，具有很大的研究价值和社会效益。目前结核病控制存在的最主要的问题是病人发现率低、治愈率低。在诊断方面，现有的检查方法均存在着一定的局限，难以达到快速、准确的结核病诊断。在治疗方面，常规的化疗药物面临着巨大的挑战，现有的药物已很难应对不断出现的耐多药临床菌株，治愈率难以提高。近40余年来，尚无新的高效抗结核药物问世。因此，加大结核分枝杆菌的基础研究，寻找快速、灵敏、简便、实用的结核病诊断新方法，提高结核病人的检出率，以及寻找新的治疗方法或者开发新的抗结核药物，是目前结核病研究需要迫切解决的问题。但现代结核病症状交叉、隐蔽，导致漏诊、误诊时有出现。临床对肺结核的诊断方法提出更高要求。常规方法的抗酸染色镜检查抗酸杆菌阳性率低，培养结果虽可靠，但耗时长，需3 8周，且阳性率也低。结核菌素试验的影响因素较多，存在假阴性等问题。活动性结核病患者细胞免疫减损而体液免疫亢进，血液及其他体液中结核抗体(主要是IgG)升高，检测出结核抗体有助于结核病的诊断。结核抗体测定对活动性肺结核诊断具有较高的实用价值。因此，结核IgG抗体可以作为新的抗结核药物的筛选靶点，与其特异性结合的分子将有可能成为新的抗结核药物。寡核苷酸适配子技术是近年来发展的一种新型的分子生物学技术，是采用指数级富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)筛选获得的。SELEX技术是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，或得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers),具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，运用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，适用于肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生长因子等，已达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究， 虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其相对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。
发明内容
为了解决上述现有技术中的问题，本发明的目的是提供了一种结核患者血清免疫球蛋白G抗体的DNA适配子及其制备方法。本发明的另一个目的是提供了应用上述适配子检测结核患者血清的方法。为了实现本发明的目的，本发明的一种结核患者血清免疫球蛋白G抗体适配子，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.1 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-CGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAACGTACCTGG -TTCGACATGAGGCCCGGATC
SEQ ID NO. 2 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-GACCTGGACGTCTTGCGCATAGTGCGGTGGCCCGC -TTCGACATGAGGCCCGGATCSEQ ID NO. 3 GGGAGCTCAGAATAA`ACGCTCAA-CGGTCAACTCGTGTA-TTCGACATGAGGCCCGGATC
上述结核患者血清免疫球蛋白G抗体适配子的制备方法，包括以下步骤
步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库，设计合成78碱基对的随机单链DNA文库
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表碱基 A、G、C、T中的任意一个，容量为IO14-1O15,并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于IgG抗体适配子的SELEX技术筛选；
步骤2，利用适配子技术筛选免疫球蛋白G抗体适配子用包被缓冲液将IgG适配子包被于微孔板中，同时设空白反筛孔及健康人血清反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔进行孵育；然后转移到IgG抗体包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与IgG抗体结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。在本发明的一个较佳实施例中，步骤I中还包括对免疫球蛋白G抗体的纯化。在本发明的另一较佳实施例中，所述纯化包括按常规方法将结核患者血清过层析柱，并用硫氰酸钾洗脱。在本发明的另一较佳实施例中，步骤2中使用SELEX结合缓冲液为20mmol/LHepes, 120mmol/LNaCl, 5mmol/LKCl, lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 结合缓冲液的pH值为7. 35。在本发明的另一较佳实施例中，步骤2中使用SELEX冲洗缓冲液为所述SELEX结合缓冲液与O. 05% Tween 20溶液的混合溶液。在本发明的另一较佳实施例中，步骤2中使用SELEX洗脱缓冲液为20 mmol/LTris-HCl, 4 mol/L异硫氰酸胍，ImmoI/L DTT，所述SELEX洗脱缓冲液pH值为8. 3。本发明的结核患者血清IgG抗体DNA适配子亲和性、特异性高，制备方法简便；其用于血清学检测能显著提高结核病人阳性检出率，可用于人及动物结核病的快速、简便诊断，可以为结核病的实验室诊断及抗结核治疗评估提高有利依据。
图1是SEQ ID NO.1的IgG抗体DNA适配子的二级结构图谱；
图2是SEQ ID NO.1的IgG抗体DNA适配子的二级结构图谱；
图3是SEQ ID NO.1的IgG抗体DNA适配子的二级结构图谱。
具体实施例方式一种结核患者血清免疫球蛋白G (IgG)抗体适配子，其具有SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。一种结核患者血清免疫球蛋白G抗体的DNA适配子的制备方法，包括以下步骤 步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库设计合成78碱基对的随机单链DNA文库·5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表碱基 AGCT中的任意一个，容量为IO14-1O15,并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于IgG抗体适配子的SELEX技术筛选；
步骤2，以微孔板为分离介质利用适配子技术筛选免疫球蛋白G抗体适配子用包被缓冲液将IgG适配子包被于微孔板中，同时设空白反筛孔及健康人血清反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔进行孵育；然后转移到IgG抗体包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与IgG抗体结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。本发明将LESEX技术引进结核分枝杆菌的研究领域，以IgG为靶物质，筛选获得IgG的适配子，为进一步利用适配子技术进行结核分枝杆菌的诊断治疗提供依据。应用上述结核患者血清免疫球蛋白G抗体的DNA适配子诊断结核病的方法，选择IgG适配子或适配子组合构建寡核苷酸酶联免疫检测体系。本发明在获得IgG适配子后，可通过选择IgG适配子或适配子组合构建寡核苷酸酶联免疫检测体系来进行结核患者血清学检测。已达到快速、准确诊断的目的。在本发明的一个实施例中，一种结核患者血清IgG抗体的DNA适配子的制备方法，包括
步骤1,(1)结核患者血清IgG抗体的纯化
用5倍体积的结合缓冲液(O. lmol/LNaHC03、0· 5mol/LNaCl, pH值为8. 3)洗层析柱；10份结核初治患者的血清过层析柱2次，过柱速度稍慢；10倍体积的结合缓冲液洗涤；ImlKSCN(硫氰酸钾10柱体积，3mol/L，pH值6.1)洗脱；柱子用结合缓冲液洗涤、蒸馏水洗柱、20%酒精洗柱；柱回收至Iml指形管中，4°C保存；洗脱馏分中回收的IgG抗体进行SDS-PAGE胶、Bradford法定量抗体浓度；回收的IgG抗体放_20°C保存待用。(2)构建随机单链寡核苷酸文库并得到纯化的单链DNA文库
构建随机单链寡核苷酸文库设计合成78碱基对的随机单链DNA文库
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表碱基 AGCT中的任意一个，容量为IO14-1O15 ;构建上游引物5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，构建下游引物 5’ -TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于IgG抗体适配子的SELEX技术筛选。设计并得到纯化的单链DNA文库可以通过一般的PCR (聚合酶链式反应)扩增、不对称PCR法和酚氯仿法纯化得到。步骤2，利用适配子技术筛选免疫球蛋白G (IgG)抗体适配子
用包被缓冲液(O. 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9. 6)将IgG适配子包被于微孔板中，同时设空白反筛孔及健康人血清反筛孔；IgG抗体包被孔和反筛孔均以5% BSA(牛血清白蛋白)封闭；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔于37°C下进行孵育，去除与BSA和微孔板结合的ssDNA ;然后转移到IgG抗体包被孔于37°C下进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液于80°C作用lOmin，洗脱与IgG抗体结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行下一轮筛选。共进行10轮筛选。在第5、7、8、9、10轮进行以健康人血清为背景的反筛。筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。该适配子即为能与IgG抗体结合的DNA适配子，其序列为序列1、序列2和序列3，并进行结构分析获得该适配子的二级结构图谱(见图1至图3)。本发明的实施例所用的SELEX结合缓冲液为20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/LCaCl2，Immol/LMgCl，结合缓冲液 pH 值为 7.35 ；SELEX 冲洗缓冲液为SELEX结合缓冲液+0. 05% Tween 20 ;SELEX洗脱缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L异硫氰酸胍，lmmol/L DTT，洗脱缓冲液的pH值为8. 3。应用本发明IgG抗体的DNA适配子进行血清检测的方法，包括
选择具有高亲和性的Ig G抗体适配子或适配子组合构建寡核苷酸酶联免疫检测体系(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay, EL0SA)用于结核病的血清学检测。适配子用分光光度计测浓度，并经99°C变性5min，冰浴IOmin进行预处理；处理后的适配子用包被液(0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9. 6)稀释，按照每孔0. μδ的浓度包被酶联板，包被过程为37°C孵育2h，4°C过夜；然后5% BSA (牛血清白蛋白)37°C下封闭Ih ；
将血清用样品稀释液按照1:25的比例稀释加入，37°C孵育30min ;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗，37°C孵育30min ;加入PBST洗涤3次，3min/次；
显色试剂A与显色试剂B按照1:1的比例混合加入，37°C孵育lOmin，加入终止液终止显色；加入PBST洗涤3次，3min/次；
利用酶标仪双波长(450nm和620nm)检测样本的吸光度值(A450，A620)。结果判断进行结果判断的OD值应为0D450nm与0D630nm的差值。阳性对照每孔OD值彡0. 5 ;阴性对照OD值< 0. 1，否则试验不成立。临界值(Cutoff)计算阴性对照平均OD值+ 0. 06 (备注阴性对照OD值低于0. 05，以0. 05计算，高于0. 05按实际值计算)。结果解释样品OD值彡临界值为结核抗体阳性；样品OD值〈临界值为结核抗体阴性。本发明的IgG抗体DNA适配子用于血清学检测能显著提高结核病人阳性检出率，可用于人及动物结核病的快速、简便诊断，可以为结核病的实验室诊断及抗结核治疗评估提闻有利依据。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发 明的范围内。
权利要求
1.一种结核患者血清IgG抗体适配子，其序列为SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2或SEQ IDNO. 3所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库，设计合成如下78碱基对的随机单链DNA文库5， -gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggATC-3，， 其中N代表碱基A、G、C、T中的任意ー个，容量为IO14-1O15 ； 步骤2，利用适配子技术筛选免疫球蛋白G抗体适配子。
3.如权利要求2所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在干，步骤I中还包括对免疫球蛋白G抗体的纯化。
4.如权利要求3所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在于，所述纯化包括按常规方法将结核患者血清过层析柱，并用硫氰酸钾洗脱。
5.如如权利要求2所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在于，步骤2 的适配子技术中使用了 SELEX 结合缓冲液20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl, 5 mmol/LKCl，lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 结合缓冲液的 pH 值为1. 35。
6.如如权利要求5所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在于，步骤2中的适配子技术使用了 SELEX冲洗缓冲液所述SELEX结合缓冲液与0. 05% Tween 20溶液的混合溶液。
7.如如权利要求2所述的结核患者血清IgG抗体适配子的制备方法，其特征在于，步骤2中的适配子技术使用了 SELEX洗脱缓冲液20mmol/L Tris-HCl, 4mol/L异硫氰酸胍，lmmol/L DTT,所述SELEX洗脱缓冲液pH值为8. 3。
全文摘要
本发明提供了一种结核患者血清IgG抗体适配子，其序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列及其制备方法。本发明的结核患者血清IgG抗体DNA适配子亲和性、特异性高，其用于血清学检测能显著提高结核病人阳性检出率，可用于人及动物结核病的快速、简便诊断，可以为结核病的实验室诊断提供有利依据。
文档编号C12N15/115GK103045600SQ201110305110
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者秦莲花, 胡忠义, 杨华, 刘忠华, 蔡江丽 申请人:上海市肺科医院