专利名称：白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法
技术领域：
本发明涉及食用菌杂种的鉴定方法，具体涉及白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法。
背景技术：
白灵菇是白灵侧耳的商品名称，又名翅鲍菇、白灵芝菇、克什米尔神菇等，其分布与新疆阿魏(/^rWa sinkiangensin K. M. Shen)的分布密切相关，仅分布在我国新疆的阿尔泰、托里、木垒、塔城等地有新疆阿魏生长的荒滩，分布海拔高度在720—1000m，其基因资源有限。杏鲍菇iPleurotus eiyngii (DC. :Fr.) Qu6l)发生于伞形花科刺芹属，刺芹枯死的植株上，在我国新疆、青海、四川西部有自然分布，基因资源较白灵菇丰富。白灵菇和杏鲍菇不仅有很高的营养价值，口感风味好，而且还有很高的药用价值， 市场前景广阔。但白灵菇的组织致密性、口感、朵形颜色优于杏鲍菇，而风味、生长周期、生物转化率和生产管理条件劣于杏鲍菇，因此，可以应用生物技术将两者的基因融合在一起， 从而获得具有白灵菇与杏鲍菇特性的杂交种，筛选出优良的杂交种，增加市场上白灵菇的品种，促进白灵菇产业的发展。为了快速筛选白灵菇与杏鲍菇的杂交种，有必要探索鉴定白灵菇与杏鲍菇杂交种的真伪。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，为有效鉴定白灵菇与杏鲍菇杂交种的真伪提供便捷的方法，进而在白灵菇与杏鲍菇的杂种中筛选出优良的杂交种，从而缩短白灵菇的育种进程。 。为了实现上述目的，本发明的技术方案是本发明的白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合、菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于
1、特异酶切片段标记的产生在8 12μ L ITS-PCR扩增产物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份为 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；
2、酶切产物的电泳检测取Eco0109I酶的酶切产物15μ L，与3 μ L上样缓冲液混勻， 点样于1. 的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记；所述上样缓冲液0. 溴酚蓝，40%蔗糖。本发明具有以下优点本发明的白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，具有检测时间短、准确性高、容易判断、稳定性好等优点。
1、检测时间短该检测所需时间短，一般只需要10 15天，比通过出菇获得子实体形态鉴定至少省40天以上。2、准确性高、稳定性好本发明以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，是区分物种的本质表现所在，而DNA序列中的保守序列更是稳定，是物种长期进化的分子标记， 不易受外界因素等的影响，因此以保守序列开发的鉴定技术准确性高，稳定性好。3、专一性强本发明充分利用酶的专一性和高效性，且本发明使用的酶对白灵菇和杏鲍菇的杂种具有特异性，产生特异识别性的标记片段，非此杂种得不到这种效果。4、容易判断本发明的判断依据是在琼脂糖电泳上出现的特异DNA标记条带，DNA 标记条带少、清晰，一目了然。
图1为Eco0109I酶的酶切电泳图；其中，M 3为泳道编号；左侧的数字和右侧的数字表示DNA片段的分子量。图1中，1 3泳道分子量为678bp，440 bp和237 bp的DNA 标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记。
具体实施例方式下面实施例对本发明做进一步的阐述。一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括以下步骤
1、白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合 选取优质、高产的白灵菇菌株和杏鲍菇菌株作为杂交亲本；
白灵菇单孢菌株原生质体制备用PDA斜面培养基活化白灵菇单孢菌株，转接于含 IOOmL PDA液体培养基的250 mL广口三角瓶中，25°C静置培养6 7d，用移液枪取5 7 mL培养液于含IOOmL PDA液体培养基的250 mL广口三角瓶中，25°C静置培养6 7d，挑取 0. 3 0. 6g幼嫩菌丝放入5mL离心管内，5000r/min离心lOmin，倒弃离心出来的液体，在 5mL离心管内加入300ul溶壁酶酶液，置观 30°C水浴锅中酶解2 2.证，用塞有棉花的注射器过滤酶解液，得到白灵菇单孢菌株原生质体；
杏鲍菇双核菌株原生质体制备用PDA斜面培养基活化杏鲍菇双核菌株，余下步骤同白灵菇单孢菌株原生质体制备；
将制备好的白灵菇单孢菌株的原生质体倒入直径为90mm的平皿在距紫外灯15cm处照射20min，把制备好的杏鲍菇双核菌株的原生质体于50°C水浴20min;把白灵菇单孢菌株和杏鲍菇双核菌株的原生质体以体积比为1 1的比例混合，再将混合液与融合剂以体积比为1 1的比例混合，30°C水浴15min，加入7-8倍体积的0. 6mol/L甘露醇稀释，取其IOOul 涂布在再生培养基上，静置培养7-10d，挑起再生菌落由步骤2继续培养；所述白灵菇菌株和杏鲍菇菌株均从市场上购得；
2、菌丝培养和收集
(1)将步骤1获得的再生菌株转接含IOOmLPDA液体培养基的250 mL广口三角瓶中；
(2)放置在25°C摇床上，转速90 130r/min培养7 10 d ；
(3)用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
(4)称取0.5 1. 3g菌丝，用滤纸包好，保存于_20°C备用。
3、CTAB法提取基因组DNA
(1)取步骤2(4)保存备用的菌丝0. 5 1. 3g放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7mL的离心管；
(2)加2.5 mL 65°C预热的抽提液，同时加入50 μ L巯基乙醇，上下震荡，使蛋白质变性沉淀；
(3)65°C水浴lh，每隔IOmin振荡1次；
(4)加入2.5 mL的氯仿异戊醇混勻，除去蛋白质；
(5)8000 r/min, 4°C离心 IOmin,取上清到 7mL 管；
(6)加1/5体积65°C预热的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 mL的氯仿异戊醇混勻；
(7)10000r/min, 4°C离心 lOmin，取上清；
(8)加入2.5 mL 65°C预热的CTAB沉淀液，颠倒混勻，65°C水浴Ih ；
(9)12000r/min, 4°C离心IOmin后，去除上清液；
(10)用0.5mL TE溶液或无菌水溶解沉淀IOmin ；
(11)加入0.25mL饱和酚和0. 25mL氯仿异戊醇，混勻；
(12)12000r/min，4°C离心lOmin，取上清，加入2倍体积在4°C预冷的无水乙醇，混勻；
(13)放置-20°C冰箱Ih或过夜；
(14)12000 r/min，4°C离心 10 min，弃上清；
(15)自然风干沉淀，用30μ L TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀，-20°C保存备用。4、ITS-PCR 扩增
ITS-PCR 扩增反应体系1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 μ L IOXPCR buffer, 2 μ L 浓度为 2. 5 m mol/L 的 dNTP, 1 μ L 浓度为 10 μ mol/L 的 ITS1, ITSl 序列为 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，，1 μ L 浓度为 10 μ mol/L 的 ITS4, ITS4 序列为 5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',Ο. 3 μ L 酶活为 5 U/uL 的 iTaq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20。ITS-PCR扩增反应程序94°C预变性5 min ;94°C变性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸1 min, 35个循环；72°C延伸10 min。5、特异酶切片段标记的产生
10 μ L ITS-PCR 扩增产物，2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer, 1 μ L Eco0109I 酶， 7μ L ddH20，37°C水浴 4h。6、酶切产物的电泳检测
取Eco0109I酶的酶切产物15 yL，与3 μ L上样缓冲液混勻，点样于1.洲的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0. 5 X TBE缓冲液中，5V/ cm电压下电泳60—90 min，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图1所示，1 3泳道显示的分子量为678bp，440 bp和237 bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种菌株的标志。我们利用本发明的方法，在数百个参加鉴定的菌株中，鉴定出白灵菇与杏鲍菇杂交菌株132个，最后筛选得到3个优良的白灵菇与杏鲍菇杂交菌株。本发明所使用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)
1、溶壁酶酶液0.6mol/L甘露醇，洲溶壁酶；
2、融合剂0.6mol/L 甘露醇，25% PEG, 1 OOnmo 1/L CaCl2 ；3、再生培养基20%马铃薯，2%葡萄糖，2%琼脂，0.6mol/L甘露醇；
4、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl, pH 8. 0;
5、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
6、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
7、TE缓冲液10 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
8、0·5XTBE :44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA;
9、上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖；
10、EB10 mg/mL 溴化乙锭；
IUPCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。本发明所使用的主要仪器如下
Sff-CJ-IFB型单人水平垂直两用净化工作台苏州净化设备有限公司；
灭菌锅上海三申；
HYG-A全温摇瓶柜太仓市实验室；
冷冻离心机Sigma 3K30 ；
PCR 扩增仪Eppendorf AG22331 Hamburg ；
掌型离心机江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机；
SDC-6节能型智能恒温槽宁波新芝生物科技股份有限公司；
凝胶成像系统TAN0N-2008。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1. 一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合、菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于(1)特异酶切片段标记的产生在8 12μ L ITS-PCR扩增产物，加入2 μ L Eco0109I 酶的酶切 Buffer，0. 8 1. 2 μ L Eco0109I 酶，5 9. 8 μ L ddH20，37°C水浴 4 7 h ；所述 Eco0109I 酶的酶切 Buffer 成份为 100mmol/L Tris-HCl, ρΗ7· 5，1 OOmmo 1/L MgCl2, 10 mmol/L Dithiothreitol ；(2)酶切产物的电泳检测取Eco0109I酶的酶切产物15μ L，与3 μ L上样缓冲液混勻， 点样于1. 的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为675 685bp、4;35 445 bp和235 M5bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记；所述上样缓冲液0. 1%溴酚蓝，40%蔗糖。
全文摘要
本发明涉及一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合、菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。酶切产物的电泳检测结果，在一个泳道上只有同时出现分子量为675～685bp、435～445bp和235～245bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记；本发明的白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，具有检测时间短、准确性高、容易判断、稳定性好等优点。
文档编号C12Q1/04GK102312012SQ20111030604
公开日2012年1月11日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者刘新锐, 吴小平, 徐美玲, 朱坚, 江玉姬, 谢宝贵, 邓优锦 申请人:福建农林大学