专利名称：用于检测番茄黄化曲叶病毒的引物、TaqMan探针和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用分子生物学方法对病毒进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技术对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物、TaqMan探针和试剂盒。
背景技术：
番茄(Zj^o/^rsico/ esculentum Mill.)是世界上重要的蔬菜作物，其品种多，营养丰富，用途广泛。病害的流行和逆境条件会限制番茄生产的发展。番茄黄化曲叶病毒病是制约番茄生产的重要病害之一，该病害引起番茄植株生长缓慢或停滞，开花结果困难，果型小等症状，致使番茄产量和质量严重降低，该病害是由双生病毒科Wriifee )菜豆金色花叶病毒属的番茄黄化曲叶病毒(Jomato yellow leaf curl virus, TYLCV)引起的，并通过烟粉虱Ofeffii1Sia to如ci)传播，随着烟粉虱在世界各地的扩展、农业耕作制度的改变、贸易活动的迅速发展以及气候的变化，番茄黄化曲叶病毒在世界范围内大面积爆发流行，目前已在中美洲、非洲、加勒比海地区、美国的加州和佛罗里达州、中东、 地中海地区、东南亚地区、墨西哥、印度、澳大利亚、日本及中国等众多的地区和国家发生 (叶青静，杨悦俭，王荣青，李志邈，阮美颖，周国治，姚祝平，番茄抗黄化曲叶病育种研究进展，中国农业科学，2009,42 ) 1230-1242)。番茄黄化曲叶病毒的危害在全球范围内日益猖獗，为了控制这类病毒，对其进行检测。常用的检测方法有血清学方法、分子生物学方法和生物学检测法。生物学检测法是通过番茄表型症状来判断是否感染发病，该方法受观察的主观性和症状产生的不确定性影响而具有一定的缺点。目前酶联免疫吸附试验(ELISA)是应用最广泛的血清学检测方法， 该方法抗血清制备需要时间较长，经常存在假阳性反应，并且很难检测出早期的病毒感染。 而分子生物学方法在敏感性和检测速度上明显提高，而且可以进行定量。PCR技术具有特异性强、快速、准确等特点，在病原体检测、疾病诊断、法医学鉴定等方面得到了广泛的应用，并且是分子生物学领域常规的方法和手段。PCR技术自1985年建立以来，不断得到改进，1996年，美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技术，该技术是在常规 PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。实时荧光定量PCR技术具有更强的特异性、自动化程度高、无EB污染等特点，是快速分子诊断的发展趋势。PCR技术为快速、准确地检测番茄植株和介体烟粉虱体内的TYLCV提供技术支持， 对快速检测番茄黄化曲叶病毒暴发病情具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供用于对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV )进行定性、定量检测的引物。
本发明所提供的引物，其上游引物碱基序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物碱基序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。序列表中的SEQ ID NO :1由23个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第856-878位碱基的反向互补序列，SEQ ID NO 2由 18个碱基组成，该序列为TYLCV基因自5’端第756-773位碱基，扩增片段长度为12!3bp。由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。上述引物既适用于番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR检测，也可用于该病毒的常规PCR检测，其检测对象是TYLCV基因。用上述引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物有123bp大小的条带，则样品中含有ITLCV。本发明还提供了用于对TYLCV进行定性、定量检测的TaqMan探针。本发明所提供的TaqMan探针，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO 3所示；所述探针是经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。所述报告荧光基团可为FAM、VIC等，淬灭荧光基团可为TAMRA、MGB等。将序列表中SEQ ID NO 3的TaqMan探针命名为TaqManProbe，序列表中的SEQ ID NO 3由31个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第824-邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为G ；同时，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-IL ；FR851297. 1)基因自5，端第拟4_邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为T。上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO 3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。本发明的第三个目的是提供一种检测ITLCV的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明所提供的检测TYLCV的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括盒体和8 支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl2, PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶和ddH20 ；其中，在另外3支PCR管中分别装有检测TYLCV的上游引物SEQ ID NO :1，下游引物SEQ ID NO :2，探针 SEQ ID NO :3。本发明提供了用于对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针，通过提取待测样品的DNA，并结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测样品中TYLCV的目的。本发明的有益效果
1、本发明所提供的引物及探针可用于番茄黄化曲叶病毒的定性及定量分析，对判断病毒在植物体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意义；
2、本发明将在番茄黄化曲叶病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发挥重要作用。
图1为杭州地区(HZ)与海宁地区(HN)感染ITLCV样品PCR扩增产物的琼脂糖凝
4胶电泳检测结果。图2为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3为阳性克隆质粒pMDIS-T-ITLCV的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图4为不同稀释浓度pMDIS-T-ITLCV标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线。图 5 为 07-020、07-025、07-(^6、07-027、07-040 和 07-0296 样品的实时荧光定量 PCR扩增曲线。图6为检测TYLCV的实时荧光定量PCR标准曲线及待测样品在标准曲线上的位
点ο
具体实施例方式通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物和探针由大连宝生物技术公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。实施例1、(用于对TYLCV进行定性、定量检测的弓丨物及TaqMan探针的设计) 根据GenBank中TYLCV的保守序列，设计扩增外壳蛋白(CP)序列的简并引物TY1/F
与TY2/R，扩增长度为356bp，对其片段进行克隆、测序和分析，并在356bp序列内部设计特异性的引物与探针。特异性的引物与探针序列如下
上游引物5，-CACCAATAACTGTAGCATGAAAT-3，(序列表中 SEQ ID NO :1)，退火温度为 54. 5 0C ；
下游引物5，-GCCCAATGGATTTTGGAC-3，(序列表中 SEQ ID NO :2)，退火温度为 3°C； 探针序列5，_ TCCTCATCACTTGAAACCTATCMCGCAAATC -3，(序列表中 SEQ ID N0:3)，退火温度为65. 3°C。序列表中的SEQ ID NO :1由23个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第856-878位碱基的反向互补序列，SEQ ID NO 2由 18个碱基组成，该序列为ITLCV基因自5’端第756-773位碱基，扩增片段长度为12!3bp。将序列表中SEQ ID NO 3的TaqMan探针命名为TaqManProbe，序列表中的SEQ ID NO 3由31个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第824-邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为G ；同时，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-IL ；FR851297. 1)基因自5，端第拟4_邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为T。 将上述TaqMan探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3端标记淬灭荧光基团TAMRA。实施例2、(用本发明的引物对TYLCV进行常规PCR检测) 本例所述番茄材料
杭州和海宁地区感染TYLCV的番茄植株。检测方法按以下步骤进行
1、基因组DNA的提取取番茄感病植株的叶片0.1克，加液氮研磨成粉末，按常规CTAB 法提取DNA后，分别保存，备用；
2、PCR扩增在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各样品DNA20 ng后，再依次加入上下游引物各0. 2 μ M，dNTP 0. 25 mM, MgCl2 2. 0 mM, 1倍的PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶 1 单位,加 ddH20 至 2(^1^后，按？0 反应程序941预变性31^11，941 30 seconds，56 59°C退火 30 seconds, 72°C 30 seconds，40 个循环进行扩增，72°C延伸 lOmin，产物 4°C保存；所述检测TYLCV的上游引物序列为SEQ ID NO :1，下游引物序列为SEQ ID NO 2 ；
3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10μ L和由0. 25%溴酚兰加 40%蔗糖配制而成的上样缓冲液2μ L，混勻，将混合物在1. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离， 至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；
4、TYLCV的检测根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图1)杭州和海宁地区感染TYLCV植株均扩增出123bp条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于TYLCV的常规PCR检测。实施例3、(用本发明的引物及TaqMan探针进行TYLCV的实时荧光定量PCR检测) 本例所述番茄材料
接种 TYLCV 40 天的番茄材料 07-020,07-025,07-026,07-027,07-040 和 07_0四。按以下步骤进行
1、基因组DNA的提取取接种ITLCV 40天的番茄植株叶片0. 1克，加液氮研磨成粉末， 按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用。2、实时荧光定量PCR标准品的制备
(1)TYLCV的PCR扩增产物回收
取实施例2获得的检测样品PCR扩增产物100 μ L，对其进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下12!3bp的目的片段，然后用胶回收试剂盒对该片段进行回收和纯化；
(2)连接
将步骤(1)回收的12!3bp的目的片段与PMD18-T载体进行连接，连接体系及条件为回收产物 5 μ L，10 χ T4 DNA 连接酶缓冲液 2 μ L，pMD18_T 载体 1 μ L (TaKaRa), 5U · μ T4 DNA 连接酶 IyL (Promega)，加 ddH20 至 10 μ L，混勻，4°C 过夜；
(3)转化
取200 μ L用CaCl2法制备的DH5 α感受态细胞，加入到步骤(2)的连接产物中，轻轻混勻，冰上放置30min，然后42°C热激90 seconds，迅速置冰上3-5min，加入ImL LB液体培养基(不含Amp)，37°C振荡培养lh，3000rpm离心％iin，弃去约800 μ L上清，用剩余上清悬浮沉淀，并将菌液涂布于 LB 平板上(含 100μ g · mL Amp, 40 μ L X-gal, 4μ L IPTG ),37 °C 振荡培养16-1 ；
(4)菌落PCR检测
随机挑取在LB平板上长出的白斑进行菌落PCR扩增，PCR反应体系及反应条件与实施例2中的常规PCR所用相同。反应结束后，取PCR扩增产物10 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，结果所有的PCR扩增均扩出12!3bp的目的条带；
(5)提取阳性克隆的质粒
挑取步骤(4)经初步鉴定的阳性单克隆，将其接种于含有Amp的LB液体培养基中， 37°C振荡培养12-1 !，然后用质粒提取试剂盒提取质粒，将该质粒命名为pMD18-T-ITLCV。 取提取的质粒PMD18-T-TYLCV 3 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，质粒PMD18-T-TYLCV的条带大小约为2. 81Λ，与预期结果相符；
(6)测序
将携带有PMD18-T-ITLCV的重组质粒进行测序，结果pMD18-T_ITLCV所携带扩增片段具有序列表中SEQ ID NO 4的核苷酸序列，表明pMD18-T-ITLCV所携带的12!3bp的扩增片段与TYLCV基因中的序列完全一致，构建的质粒序列是正确的；
(7)pMD18-T-TYLCV 的浓度测定
取pMD18-T-ITLCV原液10 μ L，稀释至100 μ L无菌重蒸水中，用紫外分光光度计测的 OD260 值为 0. 3616，1 μ L pMD18-T_TYLCV 原液的含 5. 86 X IO11 个拷贝。3、用TaqMan探针对ITLCV进行实时荧光定量PCR检测 (1)绘制标准曲线
将PMD18-T-TYLCV原液按 10 χ 系列稀释为 5. 86 χ IO3,5. 86 χ 104、5. 86 χ IO5,5. 86 χ 106、5.86 χ io7个拷贝进行实时荧光定量PCR检测，20μ L反应体系含20 mmol -L"1 Mg2 + 的 10XPCR 缓冲液 2 μ L，IOmmol .171 dNTPs 0. 4μ L, 10 mmol .171 上、下游引物各 0. 5 μ L， 2 U ·μ —的 Taq 酶 0· 2 μ L，10 mmol .171 TaqMan 探针 0· 4 μ L，DNA 1 μ L，力口 ddH20 至总体积为 20 μ L0 反应条件94 °C预变性 5 min，94 "C 30 seconds, 59 "C 50 seconds, 40 个循环，荧光信号的收集及数据的采集定在59°C。结果各个稀释浓度的pMDIS-T-TYLCV均能产生荧光信号，Ct值分别为33. 46 ,30. 56,27. 86,24. 00,20. 31，扩增曲线见图4，定量数据见表1，由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.观6，标准曲线见图6 (Y=-3. 286Χ+46. 19)；表1不同稀释浓度pMD18-T-ITLCV以及接种ITLCV材料的实时荧光定量PCR
权利要求
1.用于对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物，其特征在于该引物的上游引物碱基序列如SEQ ID NO 1所示或者如序列表中SEQ ID NO 1所示序列的衍生序列，下游引物碱基序列如SEQ ID NO 2所示或者如SEQ ID NO 2所示序列的衍生序列。
2.根据权利要求1所述的用于对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的弓I物序列。
3.用于对番茄黄化曲叶病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，其特征在于 该探针的DNA序列如SEQ ID NO 3所示或者如SEQ ID NO 3所示DNA序列的衍生序列； 所述探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
4.根据权利要求3所述的用于对番茄黄化曲叶病毒进行实时荧光定量PCR检测的 TaqMan探针，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID NO 3的基础上，在序列的5’端和/ 或3’端添加一个或多个碱基得到的序列。
5.根据权利要求3或4所述的用于对番茄黄化曲叶病毒进行实时荧光定量PCR检测的 TaqMan探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或VIC，淬灭荧光基团为TAMRA或MGB。
6.检测番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的用于对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物和权利要求3所述的用于对番茄黄化曲叶病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针。
全文摘要
本发明涉及用分子生物学方法对病毒进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量PCR技术对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物、TaqMan探针和试剂盒。该引物的上游引物碱基序列如SEQ ID NO1所示，下游引物碱基序列如SEQ ID NO2所示。探针的DNA序列如SEQ ID NO3所示，探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。试剂盒包括上述的引物和探针。本发明所提供的引物及探针可用于番茄黄化曲叶病毒的定性及定量分析，对判断病毒在植物体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意义。将在番茄黄化曲叶病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发挥重要作用。
文档编号C12N15/11GK102417934SQ201110305910
公开日2012年4月18日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者万红建, 叶青静, 周国治, 姚祝平, 李志邈, 杨悦俭, 王荣青, 阮美颖 申请人:浙江省农业科学院