专利名称：利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法
技术领域：
本发明涉及利用青霉属ipenicilliim)中具有C8羟基化酶活力的微生物菌种iPenicilliim spp.)，将大豆苷元(daidzein)转化为8-羟基大豆苷元 (8-hydroxydaidzein)的方法。转化产物为8-羟基大豆苷元(8_hydroxydaidzein)。
背景技术：
大豆苷元0’，7- 二羟基异黄酮，daidzein)，又称黄豆苷元或大豆素，是大豆异黄酮的主要成分之一。大豆苷元可利用豆科植物如大豆、Glycine max)和葛根iPueralia lobata)中的大豆苷水解获得，丰产易得，价格低廉，具有抗血栓、抗过敏、抗氧化、抗炎、降血脂和雌激素性质等多种生物活性和药理作用，并被认为是一种潜在的抗癌剂。但是大豆苷元的溶解性和生物利用度较差，且许多生物活性不是很显著，限制了它在保健食品和临床上的广泛应用。研究显示8-羟基大豆苷元的抗氧化等生物活性比大豆苷元高3(Γ300倍。 但是，8-羟基大豆苷元的天然来源报道很少，迄今仅从少数的发酵豆制品中分离得到。先是从放线菌Uti^ptomyces sp.)的发酵的豆制品中分离得到。后来从曲霉属(Aspergillus) 几种菌的大豆发酵物中得到，例如利用Asper识V^Asorj^ae或考Aspergillus saitoi发酵的大豆及其制品。但是，(1)以上报道的8-羟基大豆苷元是从大豆的发酵制品中分离得到微量产物，而以大豆苷元作为底物利用微生物进行C8羟基化结构修饰的研究报道，即真正意义上的微生物转化，只见于一篇文献，采用菌株为鼻疽奴卡菌(Nocardia farcinica) ； (2)转化率低且培养转化方式不同。以上报道，仅仅是利用HPLC检测到了极少量的8-羟基大豆苷元，或者分离得到少量的8-羟基大豆苷元，例如接种Asper识oryzae BCRC 32288, 用静置培养法从500g大豆发酵物中仅提取得到16.7 mg 8-羟基大豆苷元。
发明内容
本发明目的在于提供一种大豆苷元C8羟基化的微生物转化方法筛选获得可催化大豆苷元(daidzein)为8_羟基大豆苷元(8-hydroxydaidzein)微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得转化产物8-羟基大豆苷元。大豆苷元(daidzein)和8_羟基大豆苷元(8-hydroxydaidzein)的分子结构式见式1。
权利要求
1.利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，所述的方法是将具有大豆苷元C8羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行摇瓶发酵培养； 发酵中期，向发酵液中加入含有大豆苷元的转化液，使大豆苷元转化为8-羟基大豆苷元； 转化结束后，去除菌丝体，上清液用有机溶剂萃取，萃取液经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含有该转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、或结晶、或低温干燥处理后，可得到的转化产物晶体或粉末。
2.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的具有大豆苷元C8羟基化酶活力的微生物菌种是青霉属(/^fliciWi腫spp.) 真菌，或者是任何可使大豆苷元C8位羟基化的微生物或混合微生物。
3.根据权利要求2所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的青霉属(/^wici"/腫spp.)真菌是皮壳青霉(/^wiciBi腫crustosum ) CGMCC3. 7142、)、橘青霉 QPenicillium citrinum, ) CGMCC3. 6933、圆弧青霉 QPenicillium cyclopium var. albus) CGMCC3. 4041 > , 1 {Penicillium islandicum, )CGMCC3. 7171 )> ；1^ WM iPeniciIlium notatum, ) CGMCC 3· 6932)、敏裙青霉腫 rugulosum,) CGMCC3. 1067)、纯绿青霉(/^fliciBi腫 viridicatum) CGMCC3. 7170。
4.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的用于发酵培养的培养液，是真菌发酵培养液或其他任何适合青霉属真菌或其他能使大豆苷元C8羟基化的微生物的营养介质。
5.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的向发酵液中加入含有大豆苷元的转化液中，该底物大豆苷元溶液，是在有机相中配制；有机相为二甲基亚砜或甲醇。
6.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述转化发酵反应条件为转化温度范围在观 301，160 180 r/min摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间96 120小时，转化结束后，将转化液与菌丝体过滤或离心分开，可获得含有8-羟基大豆苷元的转化液。
7.根据权利要求6所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述发酵转化液与菌丝体分离，采用过滤分离或离心分离的方法；上清液用有机溶剂萃取。
8.根据权利要求7所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的萃取含有8-羟基大豆苷元的转化液的有机溶剂为乙酸乙酯，或任何其他可萃取产物的有机溶剂。
9.根据权利要求8所述的利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，其特征在于所述的萃取液，经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离，或kphadex纯化，或再经HPLC制备，可得到含8-羟基大豆苷元的溶液，再将含8-羟基大豆苷元的溶液经浓缩、或低温干燥处理后，可得到的8-羟基大豆苷元粉末或晶体。
全文摘要
本发明涉及利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法，该方法是将具有大豆苷元C8羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行摇瓶发酵培养；发酵中期，向发酵液中加入含有大豆苷元的转化液，使大豆苷元转化为8-羟基大豆苷元；转化结束后，去除菌丝体，上清液用有机溶剂萃取，萃取液经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含有该转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、或结晶、或低温干燥处理后，可得到的转化产物晶体或粉末。本发明的产物具有比大豆苷元30~300倍的抗氧化活性，是潜在的抗氧化、抗心血管疾病等方面的药物。
文档编号C12P17/06GK102329829SQ201110308479
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者冉昇, 周娜, 崔桂友, 黄玉军 申请人:扬州大学