专利名称：固氮斯氏假单胞菌A1501 rpoN基因的表达方法
技术领域：
本发明涉及固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的rpoN基因的表达方法，尤其涉及利用衣藻叶绿体表达系统表达斯氏假单胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的方法，属于固氮斯氏假单胞菌A1501 rpoN基因的表达领域。
背景技术：
氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是自然界中动物、植物、微生物不可缺少的生命元素。氮素在自然界有多种存在形式，数量最大的是大气中的氮气占大气体积的79%，总量约3. 9X107亿吨，但是不能为大多数生物(包括所有植物和动物)直接利用，因此氨态氮的供应成为生物界繁荣发展的主要决定因素。目前，固氮主要有以下两种方式，即工业固氮和生物固氮。工业固氮指用高温、高压、化学催化的方法；生物固氮是指某些种类的原核生物利用体内的固氮酶将空气中的氮气还原为氨，为植物生长提供氮素。人类对于生物固氮的认识要追溯到十九世纪，距今已有100多年的历史。最早在1830年，Boussingault报道豆科植物可以固氮。Hellriegel & Wilfarth于1886年报道并于1888年发表关于豆科植物能够固氮的可靠依据，并且确定了豆科植物的根瘤是固氮的主要场所。随后不久，厌氧的Clostridium pasteurianum，好养的Azotobacter chroococcum, 以及 cyanobacteria, photosynthetic bacteria, Klebsiella spp., Archaebacteria,Desulfovibrio sp.，等都加入到固氮的行列。到目前为止，随着研究的不断深入，发现自然界中可进行生物固氮的微生物种属范围分布比较广，可以分成自生固氮、 共生固氮和联合共生固氮3种。生物固氮主要依靠多数原核生物，这些原核生物之所以能够固氮，是因为固氮酶的缘故。固氮酶是一种复杂的金属酶，由钼铁蛋白和铁蛋白组成(或称为组分I和组分II， 也有称之为Dinitrogenase禾口 Dinitrogenase reductant)。固氮作用是一个复杂的过程, 其调节是在转录水平上实现的，主要是根据环境中氧气的含量和铵的水平进行调控的。固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501的rpoN基因在斯氏假单胞菌 A1501的固氮调节作用中起着非常重要的作用。RNA聚合酶需要依靠o54(rpoN基因的产物)才能启动主要nif基因簇的转录，因此才能保证某些原核生物的固氮作用。为了深入的研究固氮斯氏假单胞菌的固氮作用机理以及rpoN蛋白的功能、特性及纯化方式等，需要有大量的rpoN蛋白作为物质基础。因此，提供一种稳定、高效的表达 rpoN基因的方法能够为固氮斯氏假单胞菌的固氮调节作用机制以及rpoN蛋白的功能、特性及纯化方式等研究奠定物质基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种固氮斯氏假单胞菌 A1501的rpoN基因的表达方法，该方法以衣藻叶绿体为表达系统，能够稳定、高效的在衣藻叶绿体中表达rpoN基因。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501的rpoN基因的表达方法，包括构建rpoN基因的表达盒；将所构建的rpoN基因的表达盒插入到衣藻叶绿体表达载体上的衣藻叶绿体基因组的同源片段之间，构建得到重组衣藻叶绿体表达载体；将重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻；筛选转基因衣藻，诱导转基因衣藻中的rpoN基因表达，收获并纯化所表达的蛋白。其中，所述的斯氏假单胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示；所述的rpoN基因的表达盒由衣藻叶绿体特异启动子、rpoN基因和衣藻叶绿体特异终止子所组成，其中，rpoN基因置于衣藻叶绿体基因特异启动子和终止子的调控之下； 所述的衣藻叶绿体特异启动子包括但不限于atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL，优选为atpA 启动子；所述的衣藻叶绿体特异终止子优选为rbcL终止子。所述的衣藻叶绿体基因组的同源片段为trnE2-pSbH基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO 2所示；本发明中所用到的衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可以为任何一种野生型莱茵衣藻，均能实现本发明的技术效果；为了达到更好的技术效果，本发明所述的衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)更优选为品系 cwl5;其中，所述的重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻的方式优选采用包裹有重组衣藻叶绿体表达载体的基因枪轰击处于生长对数期后期的衣藻并通过无醋酸盐的培养基筛选得到转基因衣藻(衣藻转化子)，实验结果发现，本发明所筛选得到的转基因衣藻aadA的抗性消失。本发明采用基因同源重组技术，将来源于斯氏假单胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因构建到由衣藻叶绿体特异启动子atpA和终止子rbcL组合所驱动的表达盒，利用衣藻叶绿体基因组中的trnE2-pSbH作为同源片段，发生同源重组，通过基因枪转化法导入衣藻叶绿体中，通过PCRJestern blot等分子生物学手段检测最终获得转基因衣藻，证明斯氏假单胞菌I3Seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻叶绿体中能够稳定、高效的表达。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作为较简单的单细胞真核生物，日益吸引了细胞和分子生物学等研究领域的注意力。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞绿藻，呈椭圆形，细胞大小大约长10 μ m，宽3 μ m，具有单个杯状叶绿体，约占细胞总体积的 40%-60%。本发明采用衣藻叶绿体作为rpoN基因的表达系统，不仅弥补了核转化的不足， 而且还具有以下几方面的优点第一，本发明通过在转化载体上设计叶绿体基因组的同源片段，通过同源重组作用实现rpoN基因定点插入，避免位置效应和基因沉默的产生，保证了 rpoN基因的稳定表达。第二，衣藻叶绿体基因组遗传表达体系具有原核性。莱茵衣藻叶绿体基因组基因的排列方式、调控方式、GC碱基对含量及翻译所偏爱的密码子与原核生物相接近，这有利于直接表达rpoN基因。第三，rpoN基因在衣藻叶绿体中可稳定、高效的进行表达。本发明方法成功的将固氮斯氏假单胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻叶绿体中稳定、高效的表达，采用本发明方法能够通过衣藻叶绿体表达系统获得大量的重组rpoN蛋白，为展开固氮斯氏假单胞菌的作用机制以及rpoN蛋白的纯化、功能及特性等研究奠定了物质基础。
图1转目的基因rpoN的转基因衣藻PCR检测结果；1、野生型衣藻；2、转化子样品 1 ；3、转化子样品2。图2载体p72B-LG的结构简图。图3质粒paptY的酶切图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应了解本发明不限于本文中所述的特定方法、实验方案、细胞系、构建体和试剂且因此可加以变化。也应了解本文中所用的方法是仅用于描述特定实施例的目的，且并不意欲限制本发明的范畴，本发明的范畴将仅由随附权利要求书所限制。说明在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版.2001) ；Kriegler,Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编，1994)。除非另外定义，否则本发明所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。实验材料I.E. coli T0P10 购自 Promega 公司；固氮斯氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因由中国农业科学院生物技术所保存；野生型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)CW-15(说明本发明中所述的CW-15可以由任何一种野生型莱茵衣藻所代替，均能实现本发明的技术效果)由中国农业科学院生物技术研究所保存，具体培养方法和特性可以参考相关的文献(Hyams，J. and D. R. Davies, The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,1972. 14(4) p. 381-389) ；paptY、p72B-LG由中国农业科学院生物技术研究所保存；载体P72B-LG的插入核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，其结构简图见图1，其中，插入序列为2. 2kb, pUC9载体为2. 671Λ，载体p72B_LG的全序列为4. 871Λ。质粒paptY (pBlutscript II-aptY)的载体图谱见图2，关于paptY的构建可按照有关文献构建得至丨Ji亥质粒 paptY (Expression of human soluble TRAIL in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast. Chinese Science Bulletin 2006 Vol. 51 No. 14 1703-1709)。酶与试剂各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、Kl enow酶及其配套缓冲液购自 Promega 公司；2.生化试剂IPTG、X-Gal为!Iomega公司产品；琼脂糖为Sun biotech公司产品；Tris、dNIPs购自Sigma公司；蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨均购自0X0ID公司；溴化乙锭(EB)购自Fluka公司；HRP标记的羊抗兔rpoN抗体；TEMED (N, N，N，，N，-四甲基乙二胺)购自瑞典LKB BROMMA公司；SDS为BDH公司产品；β -巯基乙醇，Tris购自Sigma公司； 考马斯亮兰R-250、N, N'-甲叉双丙烯酰胺购自瑞士 Fluka Chemie AG公司；丙烯酰胺为 Aldrich化学有限公司产品；硝酸纤维素膜Hybond-N和尼龙膜Hybond-C均为Amersham产品；3.培养基大肠杆菌培养基为LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、 NaCl, ρΗ7. 0)；衣藻培养基为TAP培养基；实施例固氮斯氏假单胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的获得、重组衣藻叶绿体表达载体的构建和转化以及转基因衣藻的鉴定1.固氮斯氏假单胞菌I^seudomonas stutzeri A1501的rpoN基因的克隆和表达载体的构建1. 1目的基因的获得根据已知的固氮斯氏假单胞菌I3SeudomonaS stutzeri A1501的rpoN的序列，分别设计引物，并且分别引入)CbaI和HindIII位点，两对引物如下F rpoN 5' -ATCTAGAATGAAGCAAGGTTTGCAATTAAG-3‘XbaI酶切位点R rpoN 5' -AAAGCTTTCAGACCAGTTGTTTACGCTG-3‘HindIII 酶切位点在 0. 5mL Eppendorf 管中力口入
权利要求
1.一种固氮斯氏假单胞菌G^ewi/offloaas stutzeri) A1501的rpoyV基因的表达方法， 其特征在于，包括构建基因的表达盒；将所构建的基因的表达盒插入到衣藻叶绿体表达载体上的衣藻叶绿体基因组的同源片段之间，构建得到重组衣藻叶绿体表达载体；将重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻(fiWaffij^/oMwas reinhardtii)；筛选转基因衣藻，诱导转基因衣藻中的基因表达，收获并纯化所表达的蛋白。
2.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于所述基因的表达盒由衣藻叶绿体特异启动子、基因和衣藻叶绿体特异终止子所组成。
3.按照权利要求2所述的表达方法，其特征在于所述基因置于衣藻叶绿体基因特异启动子和终止子的调控之下。
4.按照权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于所述的衣藻叶绿体特异启动子包括atpA、atpB、psbA、psbD irbcL ；所述的衣藻叶绿体特异终止子为r力cZ终止子。
5.按照权利要求1-3任何一项所述的表达方法，其特征在于所述rpoN基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示。
6.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于所述的衣藻叶绿体基因组的同源片段为ir/^J-zzsM基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
7.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于所述的衣iWhleimydomorms reinhardtii )的品系为 cwl5。
8.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于所述的重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻的方式为采用包裹有重组衣藻叶绿体表达载体的基因枪轰击处于生长对数期后期的衣藻。
9.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于所述的筛选转基因衣藻是通过无醋酸盐的培养基筛选得到转基因衣藻。
全文摘要
本发明公开了一种固氮斯氏假单胞菌A1501 rpoN基因的表达方法，该表达方法包括构建rpoN基因的表达盒；将所构建的rpoN基因的表达盒插入到衣藻叶绿体表达载体上的衣藻叶绿体基因组的同源片段之间，构建得到重组衣藻叶绿体表达载体；将重组衣藻叶绿体表达载体转化衣藻；筛选转基因衣藻，诱导转基因衣藻中的rpoN基因表达，收获并纯化所表达的蛋白。本发明方法成功的将斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501的rpoN基因在衣藻叶绿体中稳定、高效的表达，为深入研究固氮斯氏假单胞菌的固氮作用机制以及rpoN蛋白的纯化、功能及特性等奠定了物质基础。
文档编号C12N1/13GK102417882SQ20111032670
公开日2012年4月18日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者刘国宪, 张志芳, 李轶女, 沈桂芳, 程奇 申请人:中国农业科学院生物技术研究所