专利名称：水稻抗稻瘟病基因Pi-y43(t)及其相关SSR标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及粳稻云引的稻瘟病抗性基因Pi_y43(t)及其相关的5对SSR多态性标记，该基因是在对稻瘟病广谱抗性品种云引的稻瘟病抗性基因Pi_y43(t)进行精细定位和图位克隆的基础上获得的，与已知的抗性基因Pib相比，含有Pi_y43(t)的云引高抗“四川-43”稻瘟病菌株，而含Pib基因的单基因鉴别系对“四川-43”表现为中抗。
背景技术：
稻痕病是由真菌(Magnaporthe oryzae)引起的广泛发生在世界各稻区最严重的病害之一。每年水稻由于稻瘟病导致的损失,约占总产量的10% 15%，损失达数十亿美元。目前控制稻瘟病流行的方式主要是使用农药进行化学防治和培育抗稻瘟病的水稻新品种。农药对环境的危害很大，容易造成环境污染，而且增加了水稻种植生产的成本。由于稻瘟病菌生理小种对抗病水稻品种的适应性选择,导致稻瘟病菌的生理小种发生改变,单个抗性位点的水稻品种往往在种植若干年后即丧失抗性。1981年福建省大面积种植的水稻品种“红410”稻瘟病抗性丧失，使当年早季稻瘟病大爆发,失收水稻面积达543. 2万hm2，损失高达数十亿公斤的稻谷。一般认为选育广谱持久抗病且具有多个抗病基因的水稻新品种是解决抗病水稻品种快速感病的有效途径之一。为提高水稻品种的稻瘟病抗性持久性，通过含有不同抗病位点基因的品种间杂交，聚合多个抗病基因，从而获得广谱持久抗病的水稻新品种。传统方法中通过苗期的抗性鉴定很难筛选到含多个抗病基因的株系，包含单一抗性位点的植物具有完全抗性就无法与含有多个抗病基因的植株区分开，结果筛选得到的抗病株系无法区分是否含有多个抗性位点。利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助筛选，能够克服依赖于苗期抗性鉴定的不足，该方法已经成功用于稻瘟病抗性多基因的聚合。
粳稻云引对福建省和四川省两省的大部分稻瘟病优势菌株具有较好的抗性，充分挖掘云引中的稻瘟病抗性基因，寻找云引中与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，利用传统育种技术与现代分子生物学技术相结合，通过基因的聚合，导入到其它优良水稻新品种中。基于表型鉴定结果的分子标记方法，通过分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA)，对云引的稻瘟病抗性基因P1-y43(t)进行精细定位，为实现这一目标，本发明开发了 5对具有良好多态性的SSR分子标记，最终将该基因定位在O. 64cM区域范围。在对目标基因区域进行了基因预测注释及表达模式分析之后，初步确定了 Piy43-3为本研究的唯一候选基因，并通过分段克隆测序拼接法及结合LR-PCR技术对候选基因进行了扩增，克隆获得P1-y43(t)。实现了 P1-y43(t)的精细定位，并获得了与Pi_y43 (t)紧密连锁的分子标记，为分子标记辅助育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于挖掘稻瘟病广谱抗性品种云引中的稻瘟病抗性基因，寻找云引中与稻痕病抗性基因紧密连锁的分子标记，服务于分子标记辅助育种。
图1RM14166在两亲本、抗感基因池及F2极端感病个性的检测。P1 :云引；P2 :丽江新团黑谷；Rp :抗病池；Sp :感病池；1-40 :极端感病个体；37 :重组单株图2Pi_y43(t)基因区域的物理重叠群图3云引稻瘟病抗性基因Pi_y43(t)遗传连锁图(cM)图4云引稻瘟病抗性基因Pi_y43(t)物理5Pi_y43(t)目标区域的基因预测图6ACTIN 检测反转的 cDNA 质量。M :DL2000 ; 1-4 :云引 0h、24h、48h、72h 样品；5-8 LTH 0h、24h、48h、72h 样品；9 :云引基因组 DNA;10 :LTH 基因组 DNA图7Piy43-3 RT-PCR 分析。M :标准分子量 DL2000 ;1_4 :云引 0h、24h、48h、72h 样品；5-8 LTH 0h、24h、48h、72h 样品图8Piy43-3cDNA 的扩增。M DL5000,1 为 68°C扩增结果图9以云引DNA为模 板扩增Pi_y43(t)基因图10注射接种“四川-43”菌株鉴定云引及Pib单基因系。LTH:丽江新团黑谷；Npb :日本晴；YY :云引；IRBLb-B, IRBL14 =Pib单基因系
具体实施例方式下文通过实施例对本发明做进一步说明实施例1P1-y43 (t)基因的精细定位及SSR标记的获得I作图群体以广谱抗病粳稻品种云引(Yunyin，云南省农业科学院提供)与普感稻痕病品种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu, LTH)杂交得到的F2群体作为精细定位群体，由312个极端感病单株和50个抗病单株组成。通过对亲本云引、丽江新团黑谷及抗感池的多态性筛选，发现含有多态性的标记10对。将筛选到的多态性标记对F2作图群体进行分析，其中标记RM3535检测到5个重组体，RM14166检测到I个重组体(图1)，另外在目标区域内检测到与目的基因P1-y43(t)共分离的标记RM6307及RM208两个SSR标记。因该区域内含有已克隆的稻瘟病抗性基因Pib，进一步的以Pib的显性标记Pibdom对作图群体进行分析，结果在312株极端感病的群体中，未能检测到重组体。2水稻基因组DNA提取采用改良的CTAB法提取水稻叶片基因组DNA，要求0D260/0D280大于1. 8。3P1-y43(t)基因区域物理重叠群的构建利用网站GRAMENE，将连锁标记着陆到粳稻品种Nipponbare基因组序列相应的BAC(BacterialArtificial Chromosome)克隆上，进一步从RGP下载到位于连锁标记之间的Nipponbare的克隆序列，并用Blast进行序列比对，分析各BAC克隆之间的重叠关系，将首尾重叠的序列按序排列，从而构建了覆盖目标基因区域的电子物理重叠图谱(图1)。4新SSR标记开发及分析为了寻找离稻瘟病抗性基因Pi_y43(t)更近的分子标记，进行精细定位，在构建了物理图谱的基础上参考Nipponbare基因组序列进行新SSR标记的开发。通过整合目标区域 BAC 克隆 0SJNBa0053Lll、0J1293_E04、P0643F09、0J1136_C12 及 0J1202_E07 的序列进SSRIT搜索，并设计相应的SSR引物30对。取SSR标记的PCR扩增产物加I μ L溴酚蓝指示剂后取2 μ L混合液,通过8. O %聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,用突光染料Genefinder在摇床上染色20min，最后在BIO-RAD凝胶成像系统上拍照记录电泳结果。结果显示仅有5对新SSR标记在对云引、丽江新团黑谷及抗、感池表现有多态性(见下表)。在目标区域开发的5对新SSR引物序列表
权利要求
1.一种cDNA序列，它具有如序列表SEQ ID 1所示的核苷酸序列。
2.—种蛋白质，它具有如SEQ ID :2所不的氣基酸序列及其功能等同序列。
3.—种水稻基因组DNA序列，它具有如序列表SEQ ID :3所不的核音酸序列。
4.5对锚定权力要求3所述核苷酸序列的SSR多态性标记。
全文摘要
一种生物技术领域的水稻抗稻瘟病基因Pi-y43(t)及其相关SSR标记。本发明涉及粳稻云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)及其相关的5对SSR多态性标记。该基因位于稻瘟病广谱抗性品种云引第2号染色体上，是在对粳稻云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)进行精细定位和图位克隆的基础上获得的，与已知的抗性基因Pib相比，含有Pi-y43(t)的云引高抗“四川-43”稻瘟病菌株，而含Pib基因的单基因鉴别系对“四川-43”表现为中抗。5对SSR多态性标记分别为OJL03、OJL08、FJK08、P4F05、FJK42，与目标基因紧密连锁，有助于提高稻瘟病分子标记辅助选择育种的选择效率和准确性。
文档编号C12N15/11GK103060336SQ20111032651
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者张建福, 谢华安, 陈锦文, 何炜, 连玲, 朱永生 申请人:张建福, 谢华安, 陈锦文