专利名称：棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重pcr检测方法及检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、 杜氏颚口线虫的检测方法，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重 PCR检测方法。此外，本发明还涉及用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物。
背景技术：
颚口线虫病是因人食入生的或未熟的含有颚口属(toathostoma)幼虫的淡水鱼引起的人畜共患寄生虫病。颚口线虫属有13个有效种，目前已报道的致病种有棘颚口线虫(G. spinigerum)、刚刺颚口线虫(G. hispidum)、杜氏颚口线虫(G. doloresi)、日本颚口线虫(G. nipponicum)、马来颚口线虫(G. malaysiae)和双核颚口线虫(G. binucleatum)，因此，对食品中检出的颚口线虫幼虫虫种的鉴别对该病的诊断与防治有重要意义。颚口线虫种类的鉴定，传统方法是以形态特征为鉴别指标，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段形态变化较大，有些虫种的第三期幼虫形态相似，传统形态方法很难鉴别，因而不能作为虫种鉴别的精确指标，且传统方法也费时费力。PCR技术具有简便、快速、灵敏的优点，目前，该技术已逐渐应用于寄生虫种类的鉴别，研究的目的基因多以核糖体DNA (rDNA)为主。真核生物rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacerregion, ITS)包括ITS-I和ITS-2，进化较快，具有种间特异性和种内保守性，是进行种间分类的极好材料，可设计特异性的引物进行扩增，并比较ITS序列的差异来鉴定形态学上难以区别的近缘种。将ITS序列用多重PCR方法来鉴别颚口线虫虫种， 目前国内尚无相关报道。棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫是亚洲最常见的3种颚口线虫致病种，本发明根据ITS-2序列，分别设计这3种颚口线虫的特异引物，进行多重PCR 扩增，旨在建立一种快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫种类的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其不需要繁杂的形态鉴定与测序步骤，就可以同时鉴别棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫三种颚口线虫。旨在解决颚口线虫鉴定时耗时、成本高、工作量大等问题，也为进一步同时鉴定所有13个颚口线虫虫种奠定了基础。该方法的建立可满足进出口水产品检疫、快速、准确的要求，同时，为我国人畜共患寄生虫病的研究与食品安全防控上提供一种新的适用方法。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。本发明是通过以下技术方案实现的在本发明的一方面，提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重 PCR检测方法，具体步骤包括1虫体DNA提取
2引物设计与筛选3PCR反应条件优化4单一 PCR扩增特异性验证5多重PCR扩增特异性验证6PCR敏感性验证7临床虫种鉴定方法的可行性验证步骤1中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA提取方法为从 70%乙醇保存液中取出单个标准虫种(3株标准虫种已经过形态学和分子生物学鉴定)，置于 1. 5mLEppendorf 管中，按照 QIAGEN 公司 DNA 提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit) 使用说明书提取颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20°C保存备用。步骤2中，所述的颚口线虫引物设计与筛选具体为应用DNAstar7. 1与 Primer5. 0等分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。表1多重PCR引物序列
权利要求
1.一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于， 具体步骤包括如下①棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取；②引物设计与筛选；③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单一PCR扩增特异性验证；⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证；⑦按照建立的多重PCR方法对临床虫种鉴定方法进行可行性验证。
2.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤①中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取方法为从70%乙醇保存液中取出单个标准虫种，采用DNA提取试剂盒提取棘颚口线虫、 日本颚口线虫、杜氏颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤②中所述的引物设计与筛选具体为应用分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应虫种的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为棘颚口线虫的特异性引物GS2-F 5' -GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’ (SEQ ID NO. 1)；GS4-R 5' -ACTGTATCGGCGAAGCTG-3‘ (SEQ ID NO. 2)；杜氏颚口线虫的特异性引物GD2-F 5' -AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3，(SEQ ID NO. 3)；GD3-R 5' -TATATACGGCCGCAGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；日本颚口线虫的特异性引物GNl-F :5，-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’ (SEQ ID NO. 5)；GN5-R 5' -TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’ (SEQ ID NO. 6)。
4.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为选择25 μ L的PCR反应体系，体系包含 25mmol/L Mg2+2. 5 μ L, 10XPCR buffer 2. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 1 μ L, 5U/ μ L Taq聚合酶0. 1 μ L，DNA模板1 μ L，引物工作浓度为10 μ mol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整步骤②的引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行51°C、53°C、 55 °C、57 °C、59 °C、61 °C退火温度梯度试验，最后确定最佳的多重PCR模式。
5.根据权利要求1或4所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR 检测方法，其特征在于，步骤③的最佳多重PCR模式具体为最佳多重PCR反应体系25yL 反应体系中IOXbuffer 2. 5 μ L, Mg2+2. 5μ L, dNTP 1 μ L，杜氏颚口线虫与日本颚口线虫上下游引物各0. 3 μ L，棘颚口线虫上下游引物各0. 4 μ L ;Taq聚合酶0. 1 μ L，模板DNA各 1 μ L，加灭菌双蒸水至25 μ L ；最佳的多重PCR反应条件为95°C 3min ；95°C 30s, 55V 30s,720C 30s, 30 个循环；72°C 5min。
6.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤④中，所述的单一 PCR扩增特异性验证具体方法为用步骤②的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的单一引物，分别对棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照步骤③的最佳多重PCR模式，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
7.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑤中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体为同时用步骤②的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫3对引物，分别对棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫及其不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照步骤 ③的最佳多重PCR模式，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
8.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑥中，所述的PCR敏感性验证具体为先将棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫3种标准虫种DNA用核酸蛋白测定仪测定模板原液浓度，再以10倍连续稀释分别将棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的DNA模板稀释成5个浓度梯度，按步骤③的最佳多重PCR模式进行PCR扩增，测定单一 PCR和多重PCR反应的敏感性。
9.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑦中，所述的临床虫种鉴定方法进行可行性验证具体为将各地检出的颚口线虫虫体，提取DNA模板，按上述建立的多重PCR方法进行扩增。
10.用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物，其特征在于，其序列为棘颚口线虫的特异性引物GS2-F :5，-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’ (SEQ ID NO. 1)；GS4-R 5' -ACTGTATCGGCGAAGCTG-3‘ (SEQ ID NO. 2)；杜氏颚口线虫的特异性引物GD2-F 5' -AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO. 3)；GD3-R 5' -TATATACGGCCGCAGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；日本颚口线虫的特异性引物GNl-F :5，-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’ (SEQ ID NO. 5)；GN5-R 5' -TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’ (SEQ ID N0. 6)。
全文摘要
本发明公开了一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，包括如下步骤首先提取颚口线虫DNA，同时进行棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异引物设计。然后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR模式进行实验，验证各引物单一PCR特异性、多重PCR特异性、PCR敏感性和临床样本操作的可行性。此外，本发明还公开了用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物序列。通过各种验证表明本发明方法可以同时鉴定棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫，其快速、敏感、特异和同步鉴定3种颚口线虫的特点可应用于水产品颚口线虫的鉴定和检疫。
文档编号C12Q1/68GK102363809SQ20111034885
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者张子群, 张强, 张鸿满, 李健, 李树清, 李雯雯, 王巧全, 王艳, 陈志飞, 陈韶红, 黄维义 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局