专利名称：过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法
过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及过表达单一 MicroRNA成熟体序列的新方法。
背景技术：
microRNA是一类长约22个碱基的、广泛存在于动植物体内的内源非编码RNA[1]。近10年来，随着对microRNA研究的不断深入,科学家们已经发现microRNA虽然不编码蛋白，但是，它们可以通过碱基互补配对的方式来识别与之相对应的靶mRNA，通过抑制翻译或是促使靶mRNA降解的方式影响基因表达[2]。microRNA能够参与诸如生长发育、免疫防御等许多生理过程，并且microRNA的调节异常可以参与到多个疾病的病理过程[3，4]。所以，microRNA作为一种新发现的基因表达调控分子有着重要的功能。
过表达所要研究的目的基因，并观察其产生的表型，是探索基因功能的一个不可或缺的方法。对于microRNA,过表达的方式目前主要有:转染人工合成的microRNA类似物或microRNA莖环前体；克隆基因组中的microRNA编码序列到过表达载体中再转染细胞。人工合成的类似物或是前体虽然可以特异性地提高细胞中的某个microRNA的表达，但是，它只能实现瞬时表达，随着细胞的增殖，其过表达水平会被稀释，难以应用到需要长时间稳定表达的研究，更难以实现体内研究。通过质粒过表达的方式，尤其是通过病毒载体进行的过表达，可以实现稳定过表达，并且转染容易，能实现体内功能的研究。
但是，目前的microRNA过表达质粒的构建,依赖于克隆基因组中的microRNA编码序列(通常将pre-miciORNA的全部序列同其上下游各一、两百个碱基一并克隆)。每个microRNA基因经过转录、加工，理论上最终都能够产生两种具有不同成熟序列的成熟体microRNA:5p-microRNA和3p_microRNA[5]。在生理条件下，对不同的microRNA,这两种成熟序列会以其中的一种为主进行表达(称为miR-X)，而另外的一种却被淘汰降解丰度很低(称为miR-X*);有时则会两种序列共同表达并存在(分别称为miR-X-5p和miR-X_3p) [6]。由于现有的质粒过表达策略是模拟细胞内部的microRNA转录和成熟的过程,而这一过程对成熟体序列有天然的选择性，所以，不能大量地过表达水平低的miR-X%也不能随心所欲地单一过表达其中的一条成熟体序列(针对miR-X-5p和miR-X-3p的情况)。
然而，随着研究深入，microRNA的功能不仅局限于早期所鉴定的表达量丰富的成熟体序列，有越来越多的研究表明，原来被认为表达丰度低的成熟体序列，在特定的条件下表达会被上调，进而发挥调节功`能[7,8]。同时，由于5p-microRNA和3p_microRNA的序列差异，其功能往往是不同的。
因此，在原有质粒过表达优势的基础上，通过新的策略，单一地过表达microRNA成熟体序列中的一种，势必为今后更精细的研究miCToRNA的功能提供了一个强有力的工具。发明内容
本发明的目的在于提供过表达单一 MicroRNA成熟体序列的新方法。在本发明的第一方面，提供一种表达单一 microRNA成熟体的方法，所述方法包括:(I)提供一种表达构建物,所述的表达构建物含有以下结构:5，Seq 正向-Y-Seq 反向 3， (I);其中，Seqfi自为该单一 microRNA成熟体相应的DNA序列；Seq1自为与Seqfi自互补的序列；Y为位于Seqj^和SeqfitJ3之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqj^和Seq&t；i)不互补；式I所示的结构可形成如下所示的二级结构:
权利要求
1.一种表达单一 microRNA成熟体的方法,其特征在于,所述方法包括: (1)提供一种表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构: 5’ Seq 正向-Y-Seq 反向 3’ (I)； 其中，Seqfi自为该单一 microRNA成熟体相应的DNA序列！Seq1自为与Seqfi自互补的序列；Y为位于Seq1自和Seq反自之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1自和Seqfi自不互补；式I所示的结构可形成如下所示的二级结构:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式I所示的结构进入细胞并被胞内加工后，基于Seq&@结构表达所述的单一 microRNA成熟体,基于Seqirt结构表达与另一 microRNA成熟体不同的RNA，其不具备另一 microRNA成熟体的活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seqi@为参照，“I”存在于与该Seqirt序列的特定位点上,该特定位点对应于所述另一microRNA成熟体发挥活性的关键位点。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seq1^1为参照，“j”存在于该序列的5’端第2-10位；且“ j”存在的个数为0-5个。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Seqtt具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的Seqfi自具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或 所述的Y具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式(I)结构的序列选自: SEQ ID NO:4中第8-60位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第8-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第6-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第5-66位所示核苷酸序列。
7.—种表达单一 microRNA成熟体的表达构建物,所述的表达构建物含有以下结构: 5’ Seq 正向-Y-Seq 反向 3’ (I)； 其中，Seq反向为该单一 microRNA相应的DNA序列！Seq1自为与Seqfi自互补的序列；Y为位于Seqirt和Seq&@之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq^^^P Seq&@不互补；式I所示的结构在可形成如下所示的二级结构:
8.如权利要求7所述的表达构建物，其特征在于，所述的Seq1^1具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的Seqfi^1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或 所述的Y具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的表达构建物，其特征在于，式(I)结构的序列选自: SEQ ID NO:4中第8-60位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第8-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第6-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第5-66位所示核苷酸序列。
10.权利要求7-9任一所述的表达构建物的用途,用于表达单一microRNA成熟体。
11.一种重组细胞，其中包含权利要求7-9任一所述的表达构建物。
12.如权利要求11所述的重组`细胞，其特征在于，所述的细胞是哺乳动物细胞。
全文摘要
本发明涉及过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。本发明首次提供了一种全新的单一microRNA成熟体表达策略，通过对表达构建物的“茎”部位的碱基互补、配对的巧妙设计，使得表达构建物能够形成茎环结构但不表达另一microRNA成熟体序列，从而专一性表达单一microRNA。本发明克服了现有技术中难以特异性表达microRNA两条成熟序列中的一条的技术难题。
文档编号C12N15/113GK103103189SQ201110359200
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者沈南, 曲波 申请人:中国科学院上海生命科学研究院