专利名称：可降解酰胺类聚阳离子及其制备方法、纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种药物技术领域的可降解亚胺类聚阳离子的合成方法，尤其涉及一种可用于核酸(DNA与RNA)的输送的可降解酰胺类聚阳离子及其制备方法、纳米颗粒。
背景技术：
DNA和SiRNA药物从概念走向临床应用的关键性瓶颈是其体内输送系统的研发。 各类基因载体中，聚阳离子载体和病毒及脂质体载体相比具有基因担载密度和担载量均大、制备简单，便于化学修饰等优势，也存在着化学毒性大、体内循环周期短(不利于靶向) 的缺点。高分子量的聚乙烯亚胺(PEI，25kDa)由于其氨基密度大，易于包裹带负电荷的基因物质而成为最早在体外和体内被广泛研究的转染活性较高的基因物质(DNA、siRNA)输送载体，但无法避免其高分量烷基骨架无法降解所带来的细胞毒性。因此设计和构建可降解的聚阳离子是提高基因物质转染活性、降低其细胞毒性的一个关键策略。比如，利用小分子量的聚乙烯亚胺通过在生理条件下可断裂的连接键构建可降解的聚乙烯亚胺类聚阳离子基因载体是本领域科学家所熟知的一个例子。俄亥俄州立大学的Robert J. Lee等最早采用交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)及双硫二丙二亚氨甲基醚(DTBP)作为连接剂分别与低分子量PEI (PEI SOODa) 交联得到高分子量可降解的聚乙烯亚胺类聚阳离子[Gosselin MA, Guo W, Lee RJ.低分子量聚乙烯可逆交联形成的有效输送基因载体。生物共轭化学，[J12001 ；12 =989-94.]。这两个含有二硫键衍生物在中国仓鼠(CHO)卵巢细胞中具有与市售高分子量PEI (25KDa)相当的转染活性，二硫键的引入使得聚合物可以被体内的还原试剂谷胱甘肽还原，从而二硫键断开，降解成为细胞毒性小的低分子量PEI，但是文献中没有给出具体的细胞毒性数据。随后有大量文献报道了将低分子量PEI (PEI SOODa)通过含有二硫键、酯键、胺酯键等能够自我断裂的连接剂交联而成的聚合物[Kloeckner J,WagnerE,Ogris M.利用多胺低聚物构建的可降解聚阳离子基因载体。].欧洲药剂学.2006 ；四414-25.等刊物]。这些研究虽然显示了概念上的可行性，小分子量的PEI以及带有各种连接剂断裂片段的低分子量PEI在人体的应用仍然不被接受。为了使降解后的低分子量PEI不带有连接剂片段，犹他大学的Sung Wan Kim等人报道了采用戊二醛作为连接剂与低分子量PEI (ISOODa)交联，生成亚胺键连接的可降解聚乙烯亚胺类聚阳离子[Kim YH, Park JH, Kim Sff, et al.通过酸敏感键构建可降解的聚乙烯亚胺类聚阳离子基因载体。[J].控制释放研究2005;103:209-19.]。这一结构的特点是细胞摄取后，凝聚基因的聚阳离子在内吞体和溶酶体的酸性条件下，与低分子量PEI直接相连的亚胺键断开，生成无细胞毒性的小分量PEI。但是亚胺键的聚合结构不能保证这一聚阳离子携带核酸进入细胞之前足够稳定，其转染活性较也不理想。为了改善亚胺结构的稳定性，Jin和du采用能够与伯胺形成带有共轭π键结构的亚胺的乙二醛作为连接剂，将人体内源性多氨基单体-精胺和亚精胺聚合成聚阳离子， 显示了较好的稳定性和基因转染活性[Du Z，Jin Τ.以人体内源性多胺单体为基本构建单元并可降解为人体内源性多胺单体的聚阳离子基因载体，用于DNA(包括DNA疫苗)包裹与输送.Jin T, 2009. J0因此，我们通过相同的连接键，利用低分子量PEI为基本构建单元并可降解为初始低分子量PEI的聚阳离子基因载体。前期我们利用乙二醛作为连接剂，将低分子量的PEI聚合为可降解为初始低分子量PEI与乙二醛的聚阳离子基因载体。体外实验显示了良好的转染效果与细胞活性。进一步利用组氨酸与丁二酸酐反应生成中间体 Histiden-acid，然后Histiden-acid与低分子量的PEI合成未见文献报道的酰胺类聚阳离子。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，在前期利用乙二醛作为连接剂，将低分子量的PEI聚合为可降解为初始低分子量PEI与乙二醛的聚阳离子基因载体的基础上提供一种可降解酰胺类聚阳离子及其制备方法、纳米颗粒。本发明构建的聚阳离子化学稳定性较好，能够紧密包裹DNA和RNA，在体内循环过程中不易降解，兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明涉及一种中间体，结构式为
权利要求
1. 一种中间体，其特征在于，结构式为:
2.一种根据权利要求1所述中间体制得的可降解酰胺类聚阳离子，其特征在于，结构式为
3.一种制备根据权利要求2所述的可降解酰胺类聚阳离子的方法，其特征在于，包括如下步骤a、在15 30°C，将组氨酸与丁二酸酐溶解在液态有机酸溶液中，搅拌、合成如权利要求1所述的中间体；b、在25 40°C条件下，将中间体、N,N' - 二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以 1:2: 5的摩尔比在无水N、N-二甲基甲酰胺中反应，然后注入溶于N、N-二甲基甲酰胺的PEI，所述PEI与中间体的摩尔比为0. 5 2，在15 30°C下缩合反应，得产物。
4.根据权利要求3所述的可降解亚胺类聚阳离子的制备方法，其特征在于，步骤a中所述组氨酸与丁二酸酐为等物质的量，所述液态有机酸为乙酸。
5.根据权利要求3所述的可降解亚胺类聚阳离子的制备方法，其特征在于，步骤b中所述在无水N、N- 二甲基甲酰胺中反应的时间为30 80min。
6.根据权利要求3所述的可降解亚胺类聚阳离子的制备方法，其特征在于，步骤b中所述PEI与中间体的摩尔比为1。
7.根据权利要求3所述的可降解亚胺类聚阳离子的制备方法，其特征在于，所述产物进一步分离纯化，步骤如下将所述产物置于透析袋透析后低温冻干真空除去水。
8.根据权利要求7所述的可降解亚胺类聚阳离子的制备方法，其特征在于，所述透析袋的分子量为10000 ；所述透析的时间为20 30小时。
9.一种纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒由包括如下步骤的方法制备而得a、将权利要求2所述的可降解酰胺类聚阳离子加超纯水、生理盐水、PBS或DEPC配置成聚阳离子溶液，将核酸物质加超纯水、生理盐水、PBS或DEPC配置成核酸物质溶液；b、将所述聚阳离子溶液快速加入到核酸物质溶液中，混合；c、将混合溶液于室温下孵育，即得所述纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其特征在于，所述核酸物质为DNA或RNA。
全文摘要
本发明涉及一种可降解酰胺类聚阳离子及其制备方法、纳米颗粒。本发明用低分子量的PEI与组氨酸构建和降解回到低分子量的PEI的起始状态的聚阳离子，该聚阳离子的制备方法为组氨酸与丁二酸酐在冰醋酸为溶剂的条件下开环反应，得到含有两个羧酸基团的中间体；然后将中间体与等物质的量的精胺通过缩合反应得到目标化合物。本发明不仅可以降解，而且在降解过程中释放出含未质子化的氨基的低分子量PEI，而且它们的降解产物不会像其他可降解的聚合物那样产生酸性基团；能够有助于逃逸溶酶体，在低表面电荷的细胞质中释放基因；对于质子海绵效应，溶酶体是由于质子海绵效应产生的渗透压破裂的，聚阳离子的氨基键起质子海绵作用。
文档编号C12N15/85GK102516178SQ20111035915
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者杜子秀, 段诗悦, 臧怡, 金拓 申请人:上海交通大学