专利名称：一种回收片状载体的方法
技术领域：
本发明涉及一种回收片状载体的方法。
背景技术：
片状载体，例如，美国NBS公司生产的Fibra disk载体，台湾赛宇潮汐式反应器应用的纸片载体，杭州安普公司激流式反应器应用的纸片载体，山东省滨州贝尔凯瑞生物工程有限公司生产的Cephodisk载体等。片状载体多为圆片状、小平行四边形、“N”形等，采用聚酯纤维、纳米合成纤维等纤维材料制成，其内部具有网格状结构，这些网格状结构构成片状载体的亲水性三维多孔隙，可以为细胞生长提供很高的比表面积(如IgFibra disk载体可提供1200cm2的生长面积)，增强细胞的贴附能力，促进细胞快速扩增。正因为如此，在细胞反应器进行大规模培养动物细胞的工艺中，片状载体的应用已非常普遍。在大规模细胞发酵过程中，片状载体的使用量会随着细胞反应器规模的增大而增加，因而在细胞反应器发酵过程中占据了主要的成本。而片状载体是一次性耗材，且价格又非常昂贵，导致细胞反应器发酵的成本非常高，例如，美国NBS公司的篮式反应器，5L反应器需添加片状载体150g，40L反应器需添加片状载体1200g，使用量很大，而其市场价格在 5(Γ60元人民币/g左右。片状载体作为一种昂贵的一次性耗材，在该种细胞反应器发酵过程中占据了主要的成本,因而,细胞发酵的生产成本较高。不仅如此,若将大量的片状载体随意丢弃堆放，易对环境造成污染，增加环境压力。而片状载体经使用后，细胞碎片与蛋白杂质残留在在片状载体三维网状结构内部，贴附在纤维束上，难以分离，因而难以清洗干净，若不经谨慎处理将其循环利用，极易对新的细胞生长造成不利影响，造成生长状态不佳，甚至死亡，进而降低目标产物的产量和质量，故目前行业内少有人对片状载体进行二次使用。
发明内容
为克服现有技术中存在的技术问题，本发明的目的提供一种回收片状载体的方法，该方法简单易行，回收成本低廉，且对环境保护有积极作用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种回收片状载体的方法，其包括以下步骤
(1)纯水清洗用温热纯水浸泡细胞发酵结束后所取出的片状载体，然后清洗，直至清洗片状载体的纯水用肉眼观察为无色且无杂质，浙干；
(2)碱液浸泡经步骤(I)处理后的片状载体置于碱液中浸泡，然后用纯水清洗至清洗后倒出的水无肉眼可见杂质，浙干；
(3)胰蛋白酶溶液消化经步骤(2)处理后的片状载体置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用纯水清洗至清洗后倒出的水中无肉眼可见杂质，浙干；
(4)酸液浸泡步骤(3)处理后的片状载体置于酸性溶液中浸泡以恢复其功能性，然后用超纯水清洗干净，至PH值为中性，清洗后倒出的水中无肉眼可见杂质，浙干；
(5)干燥对步骤(4)处理后的片状载体进行干燥处理，去除水分使之干燥。本发明先用温热纯水除去粘附在片状载体上大部分的细胞碎片与可溶于水的蛋白杂质，因为温热水相对冷水更容易将细胞碎片与蛋白杂质从载体上清洗下来；然后用碱液浸泡，使残留的蛋白变性、溶解；而碱液没有除去的剩余的小部分细胞碎片与蛋白杂质通过胰蛋白酶的消化作用除去。而后，再用酸性溶液浸泡所述片状载体材料以恢复其功能性， 使其再次使用时利于细胞贴附，此外酸液浸泡也有再次去除片状载体中杂质的作用，以尽可能将载体中的杂质去除干净。本发明推荐的实施方式是所述的步骤(I)中片状载体在热纯水中的浸泡时间可以是1(Γ20分钟，所述的清洗可以采用反复轻柔搓洗的方式，直至浸泡片状载体的纯水用肉眼观察为无色且无杂质。本发明所述步骤(I)中浸泡片状载体的温热纯水应没过所有片状载体为佳，所述温热纯水优选采用4(Γ60 V纯水即可,该温度范围的纯水不仅容易将细胞碎片与蛋白杂质从载体上清洗下来，而且温度温和适中不剧烈，便于操作人员手动处理。本发明所述步骤(2)浸泡时碱液应没过所有片状载体为佳。优选地，所述的碱液与片状载体比例为l(T20ml/g，既可以完全浸泡载体，还不会造成碱液的浪费。由于碱液浓度过低，浸泡达不到去除载体中杂质的目的，浓度过高，会对载体的内部结构造成不必要的破坏，因此，所述的碱液采用优选浓度为O. Γ0. 5mol/L的分析纯氢氧化钠(NaOH)溶液或分析纯氢氧化钾(KOH)溶液，能够在达到最大程度去除载体中杂质的同时，又保证载体内部结构的完整性。本发明更优选O. 4^0. 5mol/L的分析纯氢氧化钠或分析纯氢氧化钾。本发明所述步骤(2)中碱液浸泡应尽可能使片状载体中的残留的蛋白变性及溶解，本发明中碱液浸泡时间优选O. 5 4h，在此时间范围内已能使载体中残留的蛋白变性，时间过长，碱液浸泡的效果已无实际意义，且会延长处理时间，不利于提高处理效率。胰蛋白酶溶液消化的最佳PH值在7到8之间，此时消化力较强，故作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤(2)中，可以对经过碱液处理后的片状载体用清水清洗至呈弱碱性，这样可以利于步骤(3)中胰蛋白酶消化。本发明所述步骤(3)的胰蛋白酶溶液的用量应以没过所有片状载体为佳，所述胰蛋白酶溶液与片状载体间的比例优选在l(T20ml/g范围内，既可以使片状载体完全浸泡在胰蛋白酶溶液中，而且不会造成胰蛋白酶溶液的浪费，有利于节约载体回收成本。本发明所述步骤(3)中胰蛋白酶溶液浸泡应尽可能将碱液没有除去的剩余的小部分细胞碎片与蛋白杂质消化作用除去。而本发明中所述的胰蛋白酶溶液浸泡时间优选 O. 5 2h，在该时间范围内胰蛋白酶已能充分消化贴附在载体中的残余蛋白杂质。本发明所述步骤(3)的胰蛋白酶溶液的浓度应以能将片状载体中的细胞碎片与蛋白杂质消化完全为佳。本发明的胰蛋白酶溶液的质量体积浓度优选在O. 0259Γ0. 25% 范围内可以达到消化杂质蛋白的效果，又不造成胰蛋白酶的浪费，其具体配方为
O.025 O. 25g胰蛋白酶，IOOml PBS溶液。本发明所述步骤(3)的胰蛋白酶溶液的质量体积浓度更优选在O. 159ΓΟ. 25%范围内，可以达到消化杂质蛋白的最佳效果，同时不造成胰蛋白酶的富余浪费。而胰蛋白酶液最佳的消化条件是37 38°C，因而，所述步骤(3)中的消化温度可以控制在37 38°C范围内。
本发明所述步骤(4)的酸性溶液的用量应以没过所有片状载体为佳，优选地，所述的酸性溶液与片状载体间的比例在l(T20ml/g范围内，不仅可以使片状载体完全浸泡在酸性溶液中，而且不会造成酸性溶液的浪费,有利于节约载体回收成本。酸性溶液浓度过低，不利于片状载体的功能性恢复，浓度过高则对片状载体的功能性恢复起反作用，因此，所述步骤(4)的酸性溶液的PH范围优选为(Γ5，可以采用 O. Γ0. 5mol/L盐酸溶液，优选O. 3^0. 4mol/L的盐酸溶液，另外采用上述浓度的酸性溶液还可对经过步骤(2)和(3)处理后继续残留在片状载体中的极少量蛋白杂质起到再次清除的作用。本发明所述步骤(4)中酸性溶液浸泡应充分恢复片状载体功能性，浸泡时间过短，载体的功能性恢复不完全，时间过长增长回收的时间，因此，所述步骤(4)中酸性溶液浸泡时间优选是O. 5 lh。本发明所述步骤(5)的干燥温度不宜过高，应控制在能干燥片状载体又不破坏片状载体的材质和结构的范围内，避免片状载体的材质和结构因干燥高温而破坏。本发明的干燥温度优选控制在4(T50°C范围内，干燥时间优选在8 10小时范围内。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
I.本发明提供的方法简单易行，回收成本低廉，且在处理的过程中，碱性溶液、酸性溶液的浓度以及干燥温度适中，不易对片状载体的材质和结构造成破坏，可使片状载体的回收率达到100%，可重复利用4至5次以上，回收后的应用效率可达到回收前应用效果的90% 以上。2.经本发明回收的片状载体在重新使用前最好再用较多的细胞培养级的超纯水侵泡I小时以上，若和新片状载体混合使用，效果会更加理想。3.本发明的方法回收的片状载体可以二次利用，不仅降低了细胞发酵的生产成本，而且减少了丢弃的片状载体的堆积，减少环境污染缓解环境压力，因此本发明对环境保护就有积极作用。
具体实施例方式实施例一回收NBS公司Fibra disk载体
(I)纯水清洗上一批次细胞发酵结束后，从细胞反应器中取出片状载体，用40°C的温热纯水浸泡20分钟后，反复轻柔的搓洗片状载体，中间不断换水，直至浸泡片状载体的纯水用肉眼观察为无色，看不到杂质，用漏盆浙干。(2)碱液浸泡用纯水和分析纯NaOH配制O. 5mol/L的NaOH (分析纯)溶液，将经步骤(I)处理并浙干后的片状载体按比例10ml/g的比例浸入该NaOH (分析纯)溶液中，浸泡I小时后用纯水反复清洗，用PH试纸测定为至弱碱性为止，用漏盆浙干。(3)胰酶消化用O. 25g胰蛋白酶，IOOmlPBS配制浓度为O. 25%的胰蛋白酶溶液，将经步骤⑵处理并浙干后的片状载体按比例10ml/g的比例浸入胰蛋白酶溶液中在 37 38°C下消化2小时后用纯水反复清洗干净，用漏盆浙干。(4)酸液浸泡用纯水和浓盐酸配制O. 5mol/L盐酸溶液，将经步骤(3)处理并浙干后的片状载体按比例10ml/g的比例浸入该盐酸溶液中，浸泡O. 5小时后用纯水反复清洗，用PH试纸测定至PH值在中性附近，再用超纯水反复清洗3到6遍，清洗后倒出的水中无杂质，用漏盆浙干。(5)烘干放入电烘箱内在40°C下干燥10小时，去除片状载体上的水分，使之干燥。将回收的片状载体在用较多的细胞培养级的超纯水侵泡I小时以上，然后按以下方法进行细胞发酵，然后测试细胞耗糖量、耗氧量、病毒收获量、病毒滴度参数，结果参见表 I。将新NBS公司Fibra disk片状载体与本实施例回收一次的载体进行参数对比实验，其中所用反应器型号为NBS 510型40L反应器，添加载体1200g，细胞株为PK-15细胞， 接种总量为5*109个、接毒猪圆环2型病毒(PCV2)，接毒MOI相同。
表权利要求
1.一种回收片状载体的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)纯水清洗用温热纯水浸泡细胞发酵结束后所取出的片状载体，然后清洗，直至清洗片状载体的纯水用肉眼观察为无色且无杂质，浙干；(2)碱液浸泡经步骤(I)处理后的片状载体置于碱液中浸泡，然后用纯水清洗至清洗后倒出的水无肉眼可见杂质，浙干；(3)胰蛋白酶溶液消化经步骤(2)处理后的片状载体置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用纯水清洗至清洗后倒出的水中无肉眼可见杂质，浙干；(4)酸液浸泡步骤(3)处理后的片状载体置于酸性溶液中浸泡以恢复其功能，然后用超纯水清洗干净，至PH值为中性，清洗后倒出的水中无肉眼可见杂质，浙干；(5)干燥对步骤(4)处理后的片状载体进行干燥处理，去除水分使之干燥。
2.根据权利要求I所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对经过碱液处理后的片状载体用纯水清洗至呈弱碱性。
3.根据权利要求I或2所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(2)所述的碱液与片状载体比例为l(T20ml/g ;所述的碱液采用浓度为O. Γ0. 5mol/L的分析纯氢氧化钠溶液或分析纯氢氧化钾溶液；所述碱液浸泡时间为O. 5 4h。
4.根据权利要求3所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述胰蛋白酶溶液与片状载体间的比例在l(T20ml/g范围内。
5.根据权利要求4所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中胰蛋白酶溶液浸泡时间为O. 5^2h ;所述的胰蛋白酶溶液的质量体积浓度在O. 0259Γ0. 25%范围内。
6.根据权利要求5所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(3)的胰蛋白酶溶液的质量体积浓度在O. 159ΓΟ. 25%范围内。
7.根据权利要求6所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(4)的酸性溶液与片状载体间的比例在l(T20ml/g范围内。
8.根据权利要求7所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述的酸性溶液采用O.Γ0. 5mol/L盐酸溶液。
9.根据权利要求8所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(4)中酸性溶液浸泡时间为O. 5 lh。
10.根据权利要求9所述的回收片状载体的方法，其特征在于，所述步骤(5)的干燥温度在4(T50°C范围内，干燥时间在8 10小时范围内。
全文摘要
本发明公开了一种回收片状载体的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用温热纯水浸泡细胞发酵结束后所取出的片状载体，然后清洗；(2)碱液浸泡经步骤(1)处理后的片状载体置于碱液中浸泡，然后清洗；(3)胰蛋白酶溶液消化经步骤(2)处理后的片状载体置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后清洗；(4)酸液浸泡步骤(3)处理后的片状载体置于酸性溶液中浸泡，以恢复其功能性；(5)干燥对步骤(4)处理后的片状载体进行干燥处理，去除水分使之干燥。该方法简单易行，回收成本低廉，且对环境保护有积极作用。
文档编号C12M3/00GK102586107SQ20121003868
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者罗乃杰, 蒋天华, 赵立民 申请人:广东温氏食品集团有限公司