专利名称：用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌的引物的制作方法
用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌的引物技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的引物及其应用。
背景技术：
E. tarda是革兰氏阴性短杆菌，爱德华氏菌属，由Hoshina在1962年首次报道， 是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。该菌的宿主范围非常广泛，除可以感染多种鱼类外，也有感染两栖类、爬行类和哺乳类(包括人在内)的报道。因此，为了对 E. tarda进行及时诊断、监控和防治，建立一种快速、准确、简便的E. tarda检测技术就具有重要意义。
常规细菌鉴定方法包括对病原形态、生理生化水平及蛋白质水平等的鉴定，但由于检测灵敏度不高，测试项目较多和费时费力等缺点，不能满足快速检测的要求。近年来随着分子生物学、生化技术的快速发展，新的E. tarda的检测方法得到了应用。Chen等 (1998)、Sakai 等 Q007)、Lan 等 Q008)分别建立了基于 hemolysin、fimbrial, gyrB 基因的polymerase chain reaction(PCR)检测技术，白方方等O009)建立了 E. tarda的间接 ELISA检测方法，Castro等Q010)对以上已报道的PCR方法检测E. tarda特异性进行了比较，结果发现针对fimbriall型基因簇中的etfD基因设计的引物具有较好的特异性，对所检测的53株E. tarda结果均为阳性。以上方法较传统的细菌常规鉴定具有快速、特异等优点，但以上方法在应用中受到诸如制备抗原及抗体、需要PCR仪和凝胶电泳等专用设备的制约，在生产中不能得到普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是 Notomi等O000)发明的一种基因等温扩增技术，该技术针对靶基因序列的6个特异部位设计4条引物(F3、B3、FIP和BIP)并利用具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件下实现高效扩增，具有高特异性、高灵敏和快速反应的特点，已成为病原快速检测的重要工具。 Nagamine等^00 进一步发展了基因等温扩增技术，在原来4条引物的基础上，另添加一对也可启动链置换DNA合成的LOOP环引物LF和LB，从而有效提高反应速度。在E. tarda 检测领域，Savan等Q004)首次报道了用LAMP技术检测E. tarda的方法，该方法中根据溶血素基因设计了 4条引物，对反应温度和时间的优化结果分别为65°C和45min，应用结果表明可有效检测日本鳗鲡等4种水产动物及养殖水体中分离出的5株E. tarda。但目前尚没有利用6条引物，进行基因等温扩增技术检测E. tarda的相关研究报道，国内也没有用该技术检测E. tarda的报道。发明内容
本发明的目的是提供用于基因扩增法快速检测E. tarda的引物及其应用。首先通过生物信息学手段，针对E. tarda核苷酸序列具有种间保守及科、属间特异的区域作为引物组的设计区间。所述的核苷酸序列为该菌的hrB基因区间(964658-965302bp)和溶血素激活因子HlyB域蛋白基因HlyB核苷酸上游序列(991096_991785bp)。引物设计中采用 GenBank登记号为CP001135. 1的核苷酸序列为基础设计出6套引物组，其中三套引物组设计于hrB核苷酸序列，另三套设计于HlyB核苷酸上游序列。每套引物组包含有6条引物， 记为引物1、2、3、4、5和6。
设计于hrB基因区间的引物记为第一、二和三套
第一套引物设计如下
引物1 设计区间为964658-96469^3ρ，引物长度为；
引物2 设计区间为964841-964897bp，引物长度为；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为964672-96472^p，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 964713-964769bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为964750-964807bp，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 964814-964867bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为964694-96474^ρ，引物长度为；
引物6 设计区间为964790-96484^ρ，引物长度为20±^ρ。
第二套引物设计如下
引物1 设计区间为964687-964740bp，引物长度为；
引物2 设计区间为964865-964918bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964704-964759bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 964748-9648(^bp，引物长度为 20 士 5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964788-964844bp，引物长度为20士^p ；序列2的设计区间为 964839-964895bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为9647M-964780bp，引物长度为；
引物6 设计区间为964807-96486;3bp，引物长度为20±^p。
第三套引物设计如下
引物1 设计区间为965001_965054bp，引物长度为；
引物2 设计区间为965159-965212bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为965018-96507;3bp，引物长度为；序列2的设计区间为 965058-965115bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为965088-965144bp，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 965134-965190bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为965036_965091bp，引物长度为；
引物6 设计区间为965107-96516^3ρ，引物长度为20±^ρ。
设计于HlyB基因的上游序列区间的引物记为第四、五和六套
第四套引物设计如下
引物1 设计区间为991116-991171bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为991136-991194bp，引物长度为20 士 5bp ；序列2的设计区间为 991176-991233bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991223-99U80bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991265-991320bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为991157_991213bp，引物长度为20士5bp ；
引物6 设计区间为991243_9913(^bp，引物长度为20±^p。
第五套引物设计如下
引物1 设计区间为991096_991152bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为991116-99117Ibp，引物长度为20 士 5bp ；序列2的设计区间为 991176-991233bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991223-99U80bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991265-991320bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为991136-991198bp，引物长度为20士5bp ；
引物6 设计区间为991243-991^^ρ，引物长度为20±^ρ。
第六套引物设计如下
引物1 设计区间为991531_991586bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991729-991785bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991561-99161^ρ，引物长度为；序列2的设计区间为 991601-991660bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991661-991719bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 991712-991766bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为991579-99163^ρ，引物长度为；
引物6 设计区间为991686_991744bp，引物长度为20±^p。
上述的一套引物，其引物序列分别为SEQ ID NO 1 6。
作为第1套引物的替代，第2套引物的序列分别为SEQ ID NO :7 12 ；
第3套引物的序列分别为SEQ ID NO :13 18 ；第4套引物的序列分别为SEQ ID NO 19 24 ；第5套引物的序列分别为SEQ ID NO 25 30 ；第6套引物的序列分别为SEQ ID NO 31 36。
与本发明的引物设计区间所涵盖的序列的相似性不低于90%的其他来源的序列与本发明的引物序列相符，可用于基因扩增法快速检测E. tarda。
本发明的引物用于非疾病的诊断和治疗目的中的E. tarda的检测，包括用于制作检测试剂或试剂盒产品，用于开展E. tarda及其成分存在状况的分析、检疫和流行病学监测，用于进行环境、水体、饲料、工具的检测，用于对非患病动物受精卵、苗种、幼体、成体、亲本中可能存在的E. tarda进行检测，用于在饲料销售、药品销售、苗种销售、疫苗接种等非疾病诊断目的的服务中附带进行样品检测。
本发明引物在检测E. tarda中的体系包括有如下两种
体系1 包含引物1和引物2各0. 1-0. 3μΜ、引物3和引物4各1.2-2. 0yM、dNTP 每种1. 1-1. 7mM、Mg2+4-12mM、具有链替代活性的DNA聚合酶1-16U和经95°C变性后的待检样品DNA模板IO1-IO7拷贝的1-100 μ L反应体系中。该体系中还可以包含引物5和引物6 各0.6-1.(^] ，甜菜碱1.0-1.4]\1、111^8-!1(1 5_50mM、KCl 2_20mM、(NH4) 2S04 6-15mM 和曲拉通 X-1000. 02-2%，pH 值为 7-10。
体系2 1 对引物各 0. 1-0. 6 μ M、dNTP 每种 0. 1-0. 3mM、Mg2+l_4mM、耐热 DNA 聚合酶1-8U和待检DNA模板IO1-IO7拷贝的1-100 μ L反应体系，体系中通常还含有1Tris-HCl 5-20mM、KCl 30_70mM，pH值为7_10。上述的1对引物为引物1和引物2，或者引物5和引物6。
上述的体系1的基因扩增反应为55-67 V保温40min-lh，再经80 V保温 5-10mino
上述的体系2的基因扩增反应为94°C保温4-lOmin，1个循环；94°C保温20_30s， 50-60°C保温 20-30s，70_73°C保温 20_30s，25-40 个循环；70_73°C保温 3-lOmin，1 个循环。
上述的dNTP为dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等量混合物。
本发明所提供的用于基因扩增法快速检测E. tarda的引物具有如下的优点
1)检测时间短、灵敏度高所提供引物可在40min的反应时间即可检测出10拷贝的目的基因；
2)特异性强引物设计于具有种间保守及科、属间特异的hrB基因区间和HlyB 核苷酸上游序列，其中以4或6条特异引物组的检测是分别根据核苷酸序列中的6或8个不同区域设计，提高了检测特异性；
3)操作简单，仪器设备要求低所提供引物在检测过程中也可仅需提供恒温条件即可完成，并能通过在反应产物中加入核酸荧光染料STOR Green或GeneFinderTM或金属离子指示染料钙黄绿素等，即可对检测结果进行判断。
总之，本发明所提供的引物为可对E. tarda进行简便、快速、特异和灵敏的检测， 其应用方法也具有很强的实用性，适用于基层现场快速诊断。
具体实施方式
根据NCBI登记号为CP001135. 1中的两段具有种间保守及科、属间特异的的不同核苷酸区域序列，采用在线软件(httpV/primerexplorer. jp/e/)设计得到用于检测 E. tarda的引物，其中三套引物来自hrB核苷酸序列，另三套引物来自溶血素激活因子 HlyB域蛋白基因HlyB核苷酸上游序列，每套引物包括有6条引物，分别计为引物1、2、3、4、 5和6。各套引物的寡聚核苷酸序列设计区间要求如下8
设计于hrB基因区间的三套引物设计区间为
第一套引物
引物1 设计区间为964658-96469^3ρ，引物长度为；
引物2 设计区间为964841-964897bp，引物长度为；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为964672-96472^p，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 964713-964769bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为964750-964807bp，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 964814-964867bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为964694-96474^ρ，引物长度为；
引物6 设计区间为964790-96484^ρ，引物长度为20±^ρ。
第二套引物
引物1 设计区间为964687_964740bp，引物长度为；
引物2 设计区间为964865-96491^ρ，引物长度为；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40 士 IObp ；序列1的设计区间为964704-964759bp，引物长度为20 士 ^p ；序列2的设计区间为 964748-9648(^bp，引物长度为 20 士 5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964788-964844bp，引物长度为20士^p ；序列2的设计区间为 964839-964895bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为9647M-964780bp，引物长度为；
引物6 设计区间为964807-96486;3bp，引物长度为20±^p。
第三套引物
引物1 设计区间为965001_965054bp，引物长度为；
引物2 设计区间为965159-965212bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为965018-96507;3bp，引物长度为；序列2的设计区间为 965058-965115bp，引物长度为 20士5bp ；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为965088-965144bp，引物长度为；序列2的设计区间为 965134-965190bp，引物长度为 20士5bp ；
引物5 设计区间为965036_965091bp，引物长度为；
引物6 设计区间为965107-96516^3ρ，引物长度为20±^ρ。
设计于HlyB基因的上游序列区间的三套引物设计区间为
第四套引物
设计于HlyB基因的上游序列区间的引物信息如下
引物1 设计区间为991116_991171bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991136-991194bp相符的序列，引物长度为20士5bp ；序列2为与区间991176-991233bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991223-991280bp相符的序列，引物长度为20士5bp ；区间2为与区间99U65-991320bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物5 设计区间为991157_991213bp，引物长度为20士5bp ；
引物6 设计区间为991243_9913(^bp，引物长度为20±^p。
第五套引物
设计于HlyB基因的上游序列区间的引物信息如下
引物1 设计区间为991096-991152bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991116-991171bp相符的序列，引物长度为；序列2为与区间991176-991233bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991223-991280bp相符的序列，引物长度为20士5bp ；区间2为与区间99U65-991320bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物5 设计区间为991136-991198bp，引物长度为20士5bp ；
引物6 设计区间为991243-991^^ρ，引物长度为20±^ρ。
第六套引物
引物1 设计区间为991531-991586bp，引物长度为20士5bp ；
引物2 设计区间为991729-991785bp，引物长度为20士5bp ；
引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991561-991616bp相符的序列，引物长度为20士5bp ；序列2为与区间991601-991660bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1为与区间991661-991719bp相符的序列，引物长度为20士5bp ；区间2为与区间991712-991766bp相符的序列的反向互补序列，引物长度为；
引物5 设计区间为991579-991638bp，引物长度为20士5bp ；
引物6 设计区间为991686-991744bp，引物长度为20±^p。
根据以上要求设计得到六套引物，再对所设计的引物进行合成(商业的生物公司即可进行引物的合成)。六套引物序列如下
第1套引物
引物 1 (964663-964679bp) :5，-ACT CCA GAA CCC CCA GG-3，，SEQID NO 1 ；
引物 2(964860-964878bp) :5，-CCT CGT CCG ATA TGG CTC A_3，，SEQ ID NO 2 ；
引物3(964732-964750bp和964691-964706bp) 5'-ACC CAC CGGCTC AAC CTG ATT TTG TTG CTC AGC TCC GCC-3，，SEQ ID NO 3 ；
引物4(964769-964788bp和964833-964848bp) 5'-GAT GGA CAG CAGCTC CGC GATTTT TGA CCC TGC GCG AAC G_3，，SEQ ID NO 4 ；引物 5(964713-964729bp) :5，-CGC AAG CTG GAT GCC CA-3，，SEQID NO 5 ；引物 6(964809-964826bp) :5，-TCG GCG ACC AGC TTG AGA-3，，SEQID NO :6。第2套引物引物 1(964706-96472Ibp) :5，-CGC GTT GTG GGC ATC C_3，，SEQ IDNO 7 ；引物 2(964884-964899bp) :5，-TCC GGC TGG ACT CCC T_3，，SEQ IDNO 8 ；引物3(964767-964787bp和964723-964740bp) 5'-CGC GGA GCT GCTGTC CAT CAG TTT TGC TTG CGC ATC AGG TTG A_3，，SEQ ID NO 9 ；引物4(964807-964825bp和964858-964876bp) 5'-CCT CGG CGACCA GCT TGA GTT TTT CGT CCG ATA TGG CTC AGG-3，，SEQ ID NO 10 ；引物 5(964743-964761bp) :5，-AAA CCG TGG AGA CCC ACC G_3，，SEQID NO :11 ；引物 6(964^6-964844bp) :5，-AAT TTG CCG TTC GCG CAG G_3，，SEQID N0:12。第3套引物引物 1 (965020-965035bp) :5，-GCC GTG CCT CAG AGG A_3，，SEQ IDNO 13 ；引物 2(965178-965193bp) :5，-GCG CCG TCT CGA ATG G_3，，SEQ IDNO 14 ；引物3(965077-965096bp和965037-965054bp) 5'-TGA CGT GAT CCGTCA GCT GCT TTT GCG GTG ACG ACG ACG ATA—3，，SEQ ID NO 15 ；引物4(965107-965125bp和965153-965171bp) 5'-TGC CCG GCA GACCCA GAT CTT TTC GTT TAT GAG GCC TGC CAG-3，，SEQ ID NO 16 ；引物 5(965055-965072bp) :5，-TCG CTG GAG CGA TAT GCG-3，，SEQID NO 17 ；引物 6(965126-965147bp) :5，-GAG TAA GAC CAG ATC GGG CGAG-3，，SEQ ID NO 18。第4套引物引物 l(991135-991152bp) :5，-GTA GGG TTA CCC GTC GTC-3，，SEQID NO 19 ；引物 2(991302-991320bp) :5，-CAT CAA AAG AAG GCT GGT G_3，，SEQ ID NO :20 ；引物3(991195-991214bp_991155-991175bp) 5'-AGA AAT MG CGTCCG CGG TGT TTT ATC ACA CTG ACA TAA GGG AAT-3，，SEQ ID NO :21 ；引物4(991242-991261bp和991284-991301bp) 5'-CGG GCT AGT GCCCCA AAA TAT TTT CGC TAT TTG TCG TGC TCG-3，，SEQ ID NO :22 ；引物 5(991176-991194bp) :5，-CGG GAG ACG CTC TCC GCT T_3，，SEQ ID NO :23 ；引物 6(99U62-99U8;3bp) :5，-TCC CCG TAT TTC AGG GCG CAAG-3，，SEQ ID NO 24。第5套引物引物 1(991115-991133bp) :5，-TCA AGA TTA GCG CAT CCT T_3，，SEQ ID NO :25 ；引物 2(991302-991320bp) :5，-CAT CAA AAG AAG GCT GGT G_3，，SEQ ID NO :26 ；引物3(991195-991214bp和991135-991152bp) 5'-AGA AAT MGCGT CCG CGG TGT TTT GTA GGG TTA CCC GTC GTC-3', SEQ ID NO :27 ；引物4(991242-991261bp和991284-991301bp) 5'-CGG GCT AGTGCC CCA AAA TAT TTT CGC TAT TTG TCG TGC TCG-3', SEQ ID NO :28 ;
引物 5(991155-991179bp) :5，-GCT TAT TCC CTT ATG TCA GTG TGAT_3，，SEQ ID NO 29 ；
引物 6(991262-991279bp) :5，-TCC CCG TAT TTC AGG GCG-3，，SEQID NO :30。
第6套引物
引物 l(991550-991567bp) :5，-CGT TCC ATG CAG GGA AGA-3，，SEQID NO 31 ；
引物 2(991748-991766bp) :5，-GCT CCA GCA GTG AAT TGA C_3，，SEQ ID NO :32 ；
引物 3(991620-991641bp 和 991580-991597bp) :5，-AGC AGG CAG AAA GGC GTT TTT TTTTTC ACC GAC AGT TTG CCG TC-3，，SEQ ID NO :33 ；
引物4(991680-991700bp和991731-991747bp) 5'-CCG CGC CGT TCTGGG ACA ATA TTT TTTCGC GTG CGC TGT TCT-3，，SEQ ID NO 34 ；
引物 5(991598-991619bp) :5，-TAT TCA TAT TAT TCC CCC GGGC_3，，SEQ ID NO: 35 ；
引物 6(991705-991725bp) :5，-GAC CGA TGA GTC GCG GCG CGC-3，，SEQ ID NO:36。
检测。
实施例1 用E. tarda的基因扩增引物进行细菌特异性检测首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行E. tarda的特异性(1)细菌DNA的制备细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取，所提取的DNA 用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化。DNA样品制备后置于95°C中5min， 再冰浴5min进行变性处理后作为模板。
配制反应体系第1套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， 引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 每种 1. 4mM, MgCl2 6mM，甜菜碱 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000. 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L0上述反应体系配制完成后，混勻后分装到无菌的Eppendorf管中 (规格为200 μ L)。
(2)按照如下的反应程序进行基因扩增反应61°C保温40min，再80°C保温5min。
(3)判断检测结果反应结束后，在反应体系中加入核酸染料 GeneFindei^O. 5 μ L，然后在阳光下观察被测样品反应产物的颜色，如果是绿色荧光则表示该样品的Ε. tarda检测结果为阳性，如果为浅橙色刚表示该样品的E. tarda检测结果为阴性。
利用上述方法，对不同来源的9株E. tarda和6种弧菌的基因组DNA，即灿烂弧菌 (Vibrio splendidus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、费氏弧菌(V. fischeri)、鳗弧菌(V. anguillarum)进行了检测，另设无菌水作为阴性对照，检测结果表明模板为E. tarda管都显示为绿色荧光，而模板为6种弧菌和无菌水管均显示为浅橙色。
用本发明提供的第2套和第3套引物分别对上述样品进行检测，结果与第1套引物的检测结果一致。这一结果反映出利用本发明所提供的引物进行基因扩增检测结果具有很高的特异性，本发明所选择的引物设计区间可作为特异检测E. tarda的引物设计区间。
实施例2 用E. tarda的基因扩增引物进行细菌特异性检测
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行E. tarda的细菌特异性检测。
(1)细菌DNA的制备细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取，所提取的DNA 用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化。DNA样品制备后置于95°C中5min， 再冰浴5min进行变性处理后作为模板。
配制反应体系第4套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， dNTP 每种 1. 4mM，MgCl2 6mM，甜菜碱 1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM,曲拉通X-100 0. 1%, Bst DNA聚合酶8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L。
(2)按照如下的反应程序进行基因扩增反应61°C保温60min，再80°C保温5min。
(3)判断检测结果反应结束后，对基因扩增的产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱中有清晰的特异性梯状条带产生即为阳性检测结果，无特异性梯状条带产生即为阴性检测结果。
利用上述方法，采用第4套引物对E. tarda和6种弧菌的基因组DNA，即 V. splendidus、V.alginolyticus、V. harveyi、V.parahaemolyticus、V. fischeri、 V.anguillarum进行了检测，另设无菌水作为阴性对照。电泳图谱分析表明，模板为 E. tarda管都有特异性的梯状条带产生，而模板为6种弧菌和无菌水管均无任何条带产生。
同样，用本发明设计的第1、2、3、5和6套中引物1和引物2，引物3和引物4对上述样品进行检测，结果与第4套引物的检测结果一致。
实施例3 用E. tarda的基因扩增引物进行细菌特异性检测
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行E. tarda的细菌特异性检测。
(1)细菌DNA的制备细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取，所提取的DNA 用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化。DNA样品制备后置于95°C中5min， 再冰浴5min进行变性处理后作为模板。
配制反应体系第5套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， 引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 每种 1. 4mM, MgCl2 8mM，甜菜碱 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-100 0. 1%, Bst DNA 聚合酶 8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L。
(2)按照如下的反应程序进行基因扩增反应65°C保温45min，再80°C保温5min。
(3)判断检测结果反应结束后，对基因扩增的产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱中有清晰的特异性梯状条带产生即为阳性检测结果，无特异性梯状条带产生即为阴性检测结果。
利用上述方法，采用第5套引物对E. tarda、鲇鱼爱德华氏菌(E. ictaluri)和6种弧菌的基因组 DNA,艮口 V. splendidus、V. alginolyticus、V. harveyi> V. parahaemolyticus、 V. fischeri, V. anguillarum进行了检测，另设无菌水作为阴性对照。电泳图谱分析表明， 模板为E. tarda管都有特异性的梯状条带产生，而模板为E. ictalUri、6种弧菌和无菌水管均无任何条带产生。
用本发明提供的第4套和第6套引物分别对上述样品进行检测，结果与第5套引物的检测结果一致。这一结果反映出利用本发明所提供的引物进行基因扩增检测结果具有很高的特异性，本发明所选择的引物设计区间可作为特异检测E. tarda的引物设计区间。
实施例4 基因扩增引物进行鱼类组织中E. tarda检测
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行鱼类组织E. tarda 检测。
(1)组织DNA的制备组织样品DNA的制备采用常规酚抽提的组织核酸提取方法。 DNA样品制备后置于95°C中5min，再冰浴5min进行变性处理后作为检测用模板。
(2)配制反应体系第1套引物的引物1和引物2各0. 2 μ M，引物3和引物4各 1. 6 μ Μ，弓ι物 5 禾口弓ι物 6 各 0. 8 μ Μ，dNTP 每种 1. 4mM, MgCl2 6mM，甜菜碱 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L0
(3)按照如下的反应程序进行基因扩增反应61°C保温40min，再80°C保温5min。
(4)判断检测结果反应结束后，在反应体系中加入核酸染料 GeneFindei^O. 5 μ L，然后在阳光下观察被测样品反应产物的颜色，如果是绿色则表示该样品的Ε. tarda检测结果为阳性，如果为浅橙色则表示该样品的E. tarda检测结果为阴性。
利用上述方法对取自山东烟台的4份大菱鲆和牙鲆肠组织高疑似感染E. tarda样品都检测出阳性结果，这一结果与E. tarda的PCR检测结果一致。这一结果说明利用本发明所提供的第1套引物进行基因扩增反应可以有效进行E. tarda的特异检测。
实施例5 基因扩增引物对养殖水体样品中的E. tarda的检测
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行养殖水体中 E. tarda的检测。
(1)养殖水体的取样用无菌塑料管取待测的养殖水体10mL，室温静置lOmin，取上清液体100 μ L置于95°C中5min，再冰浴5min进行变性处理后作为模板。
(2)配制反应体系待检水样0.5 μ L，第1套引物的引物1和引物2各0.2 μ物3和引物4各1. 6 μ Μ，引物5和引物6各0.8 μ M，dNTP每种1. 4mM，MgCl2 6mM，甜菜碱 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L。
(3)按照如下的反应程序进行基因扩增反应61°C保温40min，再80°C保温5min。
(4)判断检测结果反应结束后，在反应体系中加入金属离子指示染料(500μΜ钙黄绿素1. 25 μ L和10 μ M氯化锰2 μ L)，然后在阳光下观察被测样品反应产物的颜色，如果显绿色荧光则表示该水体样品的Ε. tarda检测结果为阳性，如果为钙黄绿素试剂本身的浅红橙色则表示该水体样品的E. tarda检测结果为阴性。
同样，用本发明设计的第2、3、4、5和6套引物也可以用于对养殖水体等非活体样品中的E. tarda的检测。
实施例6 基因扩增引物对饲料样品中的E. tarda的检测
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行饲料中E. tarda的检测。14
(1)样品制备取饲料0. lg，研磨后浸泡于ImL无菌水体中，室温静置20min，取上清液体20 μ L置于95°C中5min，再冰浴5min进行变性处理后作为模板。
(2)配制反应体系第1套引物的引物1和引物2各0.4μΜ，1μ 水样，25yL 2 X Premix Ex Taq (Ex Taq 1. 25U,0. 4mM each dNTP，含有 4mM Mg2+的 Ex Taq buffer) (TaKaRa)，加无菌水至50 μ L。
(3)按照如下的反应程序进行基因扩增反应94°C预变性％iin，1个循环；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，;35个循环；72°C延伸5min，l个循环。
(4)判断检测结果反应结束后，产物于1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增效果，如果PCR产物有预期大小(两引物序列之间核苷酸的碱基数)的电泳条带出现，则表示该饲料样品的E. tarda检测结果为阳性；如果没有预期大小的电泳条带出现，则表示该饲料样品的E. tarda检测结果为阴性。
同样，用本发明设计的第1套引物中的引物5和引物6，或第2、3、4、5和6套引物中的引物1和引物2或引物5和引物6也可以用于对样品中的E. tarda的检测。
实施例7 两种基因扩增引物对E. tarda的检测灵敏度比较
首先对Savan等Q004)报道的基于溶血素基因扩增检测E. tarda引物进行合成， 引物序列如下
F3 :5，-AGC CAA CGT ACC CAG GTC—3，
B3 5' -TGG ATC TGG GTG GTC TGC-3'
FIP :5’ -GCC TTT CTT CAC CGC CCC TTT TTT GGC GTT AGC GTC GACTAC AG-3’
BIP :5’ -TTG GTA CCA TCG GCA AGC CGT TTT GGT ATC GCT GCTGCT CTG C—3’
同时合成本发明所提供的第1套引物，然后根据以下步骤进行两种基因扩增检测 E. tarda的灵敏度比较。
(1)细菌DNA反应模板的制备采用水煮法进行粗步提取，将ImL处于对数生长期的细菌(过夜培养E. tarda菌夜按1 10接种于新配制的北京陆桥技术有限责任公司生产的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，28°C振荡(150rpm)培养约3h即可)，5000 X g离心3min，弃去培养液，用250 μ L的TE缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ8. 0)重悬菌体后，置于水浴锅或金属浴中95°C煮5min后，再5000Xg离心8min，收集上清即为粗提DNA样品。DNA 样品制备后置于95°C中5min，再冰浴5min进行变性处理后作为检测用模板。
(2)配制反应体系取上述制备待检样品的DNA模板0. 5μ L，分别加入到如下基因检测反应体系中。
(a)本发明的基因扩增反应体系第1套引物中的引物1和2各0.2μΜ，引物3和引物 4 各 1. 6 μ Μ，引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 1. 4mM,MgCL2 6mM，甜菜碱 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 μ L0
(b)已报道的基于溶血素基因扩增反应体系引物FIP和BIP各1.6 μ M，引物F3和 Β3 各 0. 2 μ M，dNTP 1. 4mM, MgCL2 6mM，甜菜碱 0. 8M, Tris-HC120mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM,曲拉通X-1000. 1 %, BstDNA聚合酶8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为 25 μ L0
上述两套反应体系中的dNTP为浓度分别为IOmM的dTTP、dATP、dGTP、dCTP的等量混合物。上述反应体系配制完成后，分别混勻后分装到无菌的Eppendorf管中(规格为 200 μ L)。
(3)按照如下的反应程序进行反应
(a)本发明的基因等温扩增反应程序反应体系置于6rC保温，分别于反应后20、 30、40和50min取出不同的反应管，再80°C保温5min。
(b)已报道的溶血素基因等温扩增反应程序反应体系置于65°C保温，分别于反应后20、30、40和50min取出不同的反应管，再80°C保温5min。
(4)两套不同基因扩增检测E. tarda灵敏度比较对上述两套基因扩增检测中不同反应时间(20、30、40和50min)的产物进行凝胶电泳分析，结果显示，本发明提供的引物可在30min扩增反应后即有阳性检测结果，而已报道的基于溶血素基因扩增检测中最快有阳性检测结果的时间为50min。这一结果表明利用本发明第一套引物进行基因扩增检测 E. tarda方法较Mvan等Q004)报道的基于溶血素基因扩增检测E. tarda要更加灵敏和快速。
实施例8 基因扩增引物对E. tarda的检测灵敏度的测定及与常规PCR方法的比较
首先对本发明所提供的引物进行合成，然后根据以下步骤进行基因扩增引物对 E. tarda的检测灵敏度的测定及与常规PCR方法的比较。
(1)细菌DNA的制备细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取，所提取的DNA 用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化。DNA样品制备后置于95°C中5min， 再冰浴5min进行变性处理后作为检测用模板。
(2)构建质粒标准品。根据E. tarda(GenBank :CP001135. 1)的序列，设计用于构建E. tarda EsrB基因质粒标准品DNA片段(380bp)，引物序列如下
EsrB-sense primer5’ -GAT GCC GAT GCC AGA CAA-3’
EsrB-anti-sense primer 5' -AAA GCC CGC AGC AAA CC-3'
该片段的常规PCR方法反应程序94°C预变性％iin，1个循环；94°C变性30s，58°C 退火30s，72°C延伸30s，35个循环；72°C延伸10min，l个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化后，按天根生化科技(北京)有限公司的pGM-T 克隆试剂盒使用说明要求与载体PGM-T连接，构建含有hrB基因等温扩增所涉及序列的重组质粒pGM-EsrB，然后测定质粒浓度并作10倍稀释。
(3)灵敏度检测。将上述稀释后的质粒用作基因扩增反应的模板，用凝胶电泳分析反应产物，结果表明利用本发明提供第1套引物基因扩增方法对E. tarda检测极限为10 拷贝的目的基因。同时，将上述稀释后的质粒用作常规PCR反应的模板进行扩增，引物及反应程序同上，凝胶电泳分析PCR的反应产物，结果显示PCR检测方法对E. tarda检测极限为 1000拷贝的目的基因。
这一结果说明利用本发明所提供第1套引物进行基因扩增检测E. tarda较常规 PCR检测方法灵敏度可提高100倍。
权利要求
1.用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌的引物，其特征在于引物的设计针对迟缓爱德华氏菌hrB基因或迟缓爱德华氏菌HlyB基因上游序列。
2.如权利要求1所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物，其特征在于由迟缓爱德华氏菌 hrB基因设计的引物是来自于GenBank序列编号为CP001135. 1的964658_965302bp区间， 设计的引物信息如下第一套引物引物1 设计区间为964658-964698bp，引物长度为； 引物2 设计区间为964841-964897bp，引物长度为； 引物3:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964672-96472^ρ，引物长度为；序列2的设计区间为 964713-964769bp，引物长度为 20士5bp ；引物4:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964750-964807bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 964814-964867bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为964694-964748bp，引物长度为； 引物6 设计区间为964790-964845bp，引物长度为； 第二套引物引物1 设计区间为964687-964740bp，引物长度为； 引物2 设计区间为964865-964918bp，引物长度为； 引物3:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964704-964759bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 964748-9648(^bp，引物长度为 20 士 5bp ；引物4:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为964788-964844bp，引物长度为；序列2的设计区间为 964839-964895bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为964724-964780bp，引物长度为； 引物6 设计区间为964807-964863bp，引物长度为； 第三套引物如下引物1 设计区间为965001-965054bp，引物长度为； 引物2 设计区间为965159-965212bp，引物长度为； 引物3 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为965018-96507;3bp，引物长度为；序列2的设计区间为 965058-965115bp，引物长度为 20士5bp ；引物4:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为965088-965144bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 965134-965190bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为965036-965091bp，引物长度为； 引物6 设计区间为965107-965166bp，引物长度为20±^p。
3.如权利要求2所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物，其特征在于所述的第一套引物、第二套引物、第三套引物的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:1 6、SEQ ID NO :7 12或SEQ ID NO 13 18。
4.如权利要求1所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物，其特征在于由HlyB核苷酸上游序列设计的引物是来自于GenBank编号为CP001135. 1的991096_991785bp的区间，设计的引物信息如下第四套引物引物1 设计区间为991116-991171bp，引物长度为； 引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为； 引物3:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991136-991194bp，引物长度为20士5bp ；序列2的设计区间为 991176-991233bp，引物长度为 20士5bp ；引物4:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991223-99U80bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991265-991320bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为991157-991213bp，引物长度为； 引物6 设计区间为991M3-991302bp，引物长度为； 第五套引物引物1 设计区间为991096-991152bp，引物长度为； 引物2 设计区间为991283-991339bp，引物长度为； 引物3:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991116-991171bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991176-991233bp，引物长度为 20士5bp ；引物4 该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991223-99U80bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991265-991320bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为991136-991198bp，引物长度为； 引物6 设计区间为991M3-991298bp，引物长度为； 第六套引物引物1 设计区间为991531-991586bp，引物长度为； 引物2 设计区间为991729-991785bp，引物长度为； 引物3:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991561-99161^ρ，引物长度为；序列2的设计区间为 991601-991660bp，引物长度为 20士5bp ；引物4:该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为 40士 IObp ；序列1的设计区间为991661-991719bp，引物长度为；序列2的设计区间为 991712-991766bp，引物长度为 20士5bp ；引物5 设计区间为991579-991638bp，引物长度为； 引物6 设计区间为991686-991744bp，引物长度为20±^p。
5.如权利要求4所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物，其特征在于所述的第四套引物、第五套引物、第六套引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO 19 M、SEQ ID NO :25 30或 SEQ ID NO 31 36。
6.权利要求1所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物，用于非疾病的诊断和治疗目的中的迟缓爱德华氏菌的检测包括用于制作检测试剂或试剂盒产品，用于开展迟缓爱德华氏菌及其成分存在状况的分析、检疫和流行病学监测，用于进行环境、水体、饲料、工具的检测， 用于对非患病动物受精卵、苗种、幼体、成体、亲本种的迟缓爱德华氏菌进行检测，用于在饲料销售、药品销售、苗种销售、疫苗接种的非疾病诊断目的的服务中附带进行样品检测。
7.如权利要求6所述的检测，是通过基因扩增反应来完成的，一种反应体系如下至少包含有权利要求3或权利要求5所述的任一套引物的引物1和引物2各0. 1-0. 3 μ M、引物3 和引物4各1. 2-2. 0 μ M、dNTP 1. 1-1. 7mM、Mg2+4-12mM、具有链替代活性的DNA聚合酶1-16U 和经95°C变性后的待检样品DNA模板IO1-IO7拷贝的1-100 μ L反应体系中，经55-67°C保温 40min-lh，再经 80°C保温 5_10min。
8.如权利要求7所述的检测，其特征在于反应体系还包含有对应于引物1和引物 2所在的一套引物中的引物5和引物6各0. 6-1. 0 μ M,以及甜菜碱1.0-1.4Μ、Tris-HCl 5-50mM、KCl 2_20mM、(NH4)2SO4 6-15mM 和曲拉通 X-1000. 02-2%，pH 值为 7-10。
9.如权利要求6所述的检测，是通过基因扩增反应来完成的，反应体系至少包含有1对引物各 0. 1-0. 6μΜ、(1ΝΤΡ 0. 1-0. 3mM、Mg2+ l_4mM、耐热 DNA 聚合酶 l-8U、Tris_HCl 5_20mM、 KCl 30-70mM、待检DNA模板IO1-IO7拷贝，pH为7-10的1-100 μ L反应体系中，经94°C保温4-lOmin，再经25-40个循环反应，每个循环反应包括94°C保温20_30s，50-60°C保温 20-30s，70-73°C保温20_30s ；最后经70_73°C保温3-lOmin ；所述的1对引物为权利要求3 或5所述的任一套引物的引物1和引物2，或者引物5和引物6。
全文摘要
本发明公开了用于快速检测迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的基因扩增引物。该引物以E.tarda的esrB或迟缓爱德华氏菌hlyB上游序列为目标设计出特异性引物，利用上述引物进行基因扩增的检测方法具有简便、快速、特异和灵敏的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在40min检测出10拷贝目的基因，适用于E.tarda的现场快速检测，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK102559914SQ20121003854
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者刘莉, 史成银, 张庆利, 杨冰, 王秀华, 谢国驷, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所