专利名称：哈维氏弧菌的荧光定量pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的突光定量PCR快速检测方法。
背景技术：
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是革兰氏阴性菌，菌体杆状，极生单鞭毛运动，TCBS (Tniosulfate citrate bile salts sucrose agar culture mediumノ 平十反上生长，落呈黄色或緑色，嗜盐菌。哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中，是条件致病菌。在适宜的条件下，它们大量繁殖成为优势菌，通过消化道或者伤ロ感染，致使伤ロ肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变而导致海水动物发病死亡，是水产养殖动物鱼、虾的重要致病菌。现有哈维氏弧菌的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用荧光定量PCR方法快速检测哈维氏弧菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法。研究表明哈维氏弧菌携带的toxR基因是其毒力基因的表达调控基因。本发明根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站上公布的哈维氏弧菌toxR基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量PCR快速技术检测哈维氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中哈维氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。本发明的技术解决方案是ー种快速检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤(I)首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。(2)荧光定量PCR反应液(25 μ L体系)其中包括提取的基因组DNA，I μ L ； 10 X PCR buffer，2. 5μ L ;Mg2+，2mmol/L ;Taq 酶2U ；UNG 酶 IU ；dNTP 0. 2mmol/L ;哈维氏弧菌特异性引物 200nmol ；TaqMan 探针 200nmol，最后加灭菌去离子水至25 μ L0(3)荧光定量PCR仪程序參数94°C预变性IOmin ;94°C变性15s，60°C退火lmin，同时收集FAM荧光，40个循环，40 V Imin，4 V保存。其中哈维氏弧菌特异性引物为上游引物Vharveyi-I :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物Vharveyi-2 :5' -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特异性TaqMan探针为Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'
荧光定量PCR反应结束后，哈维氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值
<35。本发明提供了扩增哈维氏弧菌的特异性引物Vharveyi-1、Vharveyi-2和TaqMan探针Vharveyi-3，从而提供了一种快速检测哈维氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势快 速性没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。灵敏度高光谱技术和计算机技术的联合使用，极大提高了检测的灵敏度。特异性强荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。有效解决PCR污染整个过程均在单管中进行，且勿需打开管盖，避免了 PCR产物对实验室的污染。
具体实施例方式首先无菌操作取25g待测水产品，充分剪碎，放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器中，进行10倍梯度稀释后，选择2 3个适当稀释度，各以O. ImL涂布到TCBS平板上，在360C ±1°C培养箱中，倒置培养24h±3h。挑取5个可疑菌落提取基因组DNA并稀释备用。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取进行基因组DNA提取并稀释备用。最后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25 μ L，其中包括提取的基因组 DNA，I μ L ； 10 X PCR buffer, 2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ;Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP0. 2mmol/L ;哈维氏弧菌特异性引物200nmol ;TaqMan探针200nmol,最后加灭菌去离子水至25 μ L0设置荧光定量PCR仪器的程序参数为94°C预变性IOmin ;94°C变性15s，60°C退火Imin，同时收集FAM荧光，40个循环，40°C lmin，4°C保存。其中哈维氏弧菌特异性引物为上游引物Vharveyi-1 :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物Vharveyi-2 :5' -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特异性TaqMan探针为Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'荧光定量PCR反应结束后，哈维氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值
<35。核苷酸序列表<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>哈维氏弧菌的荧光定量PCR快速检测方法<160>3〈210〉I<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (19)
〈400〉IGAGTTCGTATGGCGGGAGC 19<210>2〈211 >21<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind <222>(1). . . (21)<400>2GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG 21<210>3<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (22)<400>3TCCACTCTACGTAAAATGTTGA 2权利要求
1.一种快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用哈维氏弧菌保守性强的基因组DNA序列设计特异性引物和探针；最后使用该引物和探针对待测水产品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和荧光信号的检测。其中所述的哈维氏弧菌特异性引物为上游引物 Vharveyi-I :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物 Vharveyi-2 5/ -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特异性TaqMan探针为Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'
2.根据权利要求I所述的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法，其反应总体积为 25μ L，包括提取的基因组 DNA，I μ L ；10XPCR buffer, 2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ;Taq 酶 2U ；UNG酶IU ；dNTP 0. 2mmol/L ;哈维氏弧菌特异性引物200nmol ;TaqMan探针200nmol，最后加灭菌去离子水至25 μ L0
3.根据权利要求I所述的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法，其荧光定量PCR仪器的程序参数为94°C预变性IOmin ;94°C变性15s，60°C退火lmin，同时收集FAM荧光，.40 个循环，40°C lmin，4°C保存。
全文摘要
本发明公开了一种哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的荧光定量PCR快速检测方法，采用哈维氏弧菌特异性引物和TaqMan探针，即可对水产品中哈维氏弧菌进行检测与监控。其中上游引物Vharveyi-15′-GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3′，下游引物Vharveyi-25′-GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3′，特异性TaqMan探针为Vharveyi-35′-TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3′。检测哈维氏弧菌的方法包括细菌基因组DNA的提取、哈维氏弧菌的荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高。另外，本发明与普通PCR技术相比，不需要凝胶电泳拍照观察，实现了检测流程一体化封闭检测，避免了PCR产物对实验室的污染。
文档编号C12R1/63GK102618643SQ20121007764
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者唐静, 房保海, 李正义, 祝素珍, 贾俊涛, 赵丽青, 马维兴 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心