专利名称：一种包含l-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用。
背景技术：
随着L-丙氨酸生产工艺的日臻成熟，利用L-丙氨酸生产高附加值衍生产品的需求与日俱增，其中DL-丙氨酸的高效和绿色生产工艺正得到业界的重视。DL-丙氨酸是L-丙氨酸的结构消旋物，其化学名称是DL- α -氨基丙酸(简称丙氨酸)，分子式为CH3CH(NH2) C00H，成品是无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末，有较强的甜味，易溶于水、无旋光性。
权利要求
1.一种L-丙氨酸消旋酶，其特征在于，它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.—种权利要求I所述的L-丙氨酸消旋酶的编码基因，其特征在于，它具有如SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
3.一种外源表达L-丙氨酸消旋酶的基因工程菌，其特征在于，它包含如SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤(1)构建含有L-丙氨酸消旋酶基因的表达载体提取发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA作为模板，以包含EcoRI和NotI酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增引物 I :5’ -GGAATTCATGGTAAGTGCAC-3，；引物 2 :5，-AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC-3，；PCR扩增体系为:基因组DNA 2yL，引物I和引物2各2yL，dNTP 4 μ L，IOXTaq缓冲液 5 μ L, Taq 酶 I μ L, ddH20 34 μ L ；PCR反应程序为94°C预变性2min ;94°C变性30s，然后50°C退火lmin，72°C延伸lmin， 循环25次；最后72°C延伸IOmin ；回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，与经过同样双酶切的质粒 pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET_alr。(2)将重组质粒pET-alr转化至宿主细胞中将重组质粒pET-alr转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基，37°C培养12 16h得到单克隆；(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取单克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养过夜；提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI酶切；根据电泳结果判断含有与air基因相同分子量大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-alr，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
5.一种L-丙氨酸消旋酶的表达方法，其特征在于，将包含如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以O. 5 10% (v/v)的接种量转接入发酵培养基中，20 40°C发酵培养I 3h，再加入终浓度O. I 10g/L的乳糖或终浓度O. I I. 5mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20 40°C下诱导表达3 48h。
6.根据权利要求5所述的L-丙氨酸消旋酶的表达方法，其特征在于，所述的发酵培养基，其碳源的是L-丙氨酸，浓度为10 50g/L ;氮源是蛋白胨或酵母粉，浓度为5 40g/L ； 发酵培养基用氨水或NaOH调整培养基pH值到4 10，经高压湿热灭菌后即可使用。
7.权利要求3所述的基因工程菌在制备DL-丙氨酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将L-丙氨酸加入到经过诱导表达的基因工程菌的发酵液中，维持反应温度4 60°C，反应3 24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为O时，停止反应，加入活性炭在20-80°C脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将经过诱导表达的基因工程菌发酵液离心并收集菌体，加入L-丙氨酸水溶液，重新悬浮菌体，调整溶液pH值为7 14，维持反应温度4 60°C，反应3 24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为O时，停止反应，离心收集菌体，加活性炭至上清液中，在20-80°C脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品；二次收集的菌体可以重复用于DL-丙氨酸的生产直至酶活性完全丧失。
全文摘要
本发明公开了一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用。该菌株包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明的基因工程菌可以通过消旋L-丙氨酸生产DL-丙氨酸，且用量少、反应时间短、可以多批次重复利用，通过本发明的基因工程菌，消旋过程的转化率达到99.0％以上，产品纯度达到99.5％以上，具有良好的产业化前景。
文档编号C12N9/00GK102604899SQ20121007756
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者冯小海, 徐虹, 徐铮, 李莎, 许露 申请人:南京工业大学