专利名称：一种高亲和力青霉素结合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测领域。更具体的，本发明涉及分子改造获得的高亲和力青霉素结合蛋白及其在农副产品中￠-内酰胺类抗生素残留快速检测中的应用。
背景技术：
奶牛在养殖过程中易患乳房炎、阴道炎等疾病，由于P -内酰胺类抗生素药效好、价格低廉，奶农在奶牛患病时大量使用，导致原料乳中￠-内酰胺类抗生素残留现象普遍，在很大程度加大了乳制品企业奶源质量安全控制的难度，而含有￠-内酰胺类抗生素残留的乳制品会影响到消费者的身体健康和生命安全。因此，农业部出台了行业标准《无公害食品生鲜牛乳》(NY5045-2008)，要求乳制品企业必须检测原料乳中P -内酰胺类抗生素残 &3甶o青霉素结合蛋白是细菌细胞壁合成的重要的酶，具有￠-内酰胺环结构的抗生素类似其底物，与其可发生不可逆结合。因此，青霉素结合蛋白是实现3 -内酰胺类抗生素残留快速检测最具潜力的蛋白。但目前已知的青霉素结合蛋白与￠-内酰胺类抗生素的亲和力达不到国家要求的检测标准，为实现快速检测￠-内酰胺类抗生素，迫切需要找到与3-内酰胺类抗生素亲和力更高的青霉素结合蛋白。目前，乳制品企业使用的内酰胺类抗生素快速检测产品主要以进口产品为主，如美国Snap公司和比利时UniSensor公司。本发明针对我国P _内酰胺类抗生素快速检测产品存在的检测限达不到国家标准问题，利用计算机辅助设计、量子化学、分子生物学、分析化学等方法，对无乳链球菌青霉素结合蛋白(PBP Ib)的第526位和547位氨基酸进行分子改造，开发了一种新的高亲和力青霉素结合蛋白。本发明中，命名这种高亲和力青霉素结合蛋白为WFYZH-Pro-P -lactam，其对应基因为WFYZH-Gen-P -lactam，表达载体为WFYZH-Bdzt- P -lactam。本发明以WFYZH-Pro- ^ -Iactam作为分子识别原件,开发了一种^-内酰胺类抗生素快速检测试纸条。
发明内容
本发明的目的是提供一种与P -内酰胺类抗生素亲和力更高的青霉素结合蛋白(WFYZH-Pro-0-lactam)。本发明涉及的保藏菌株为大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院，100101，中国)，保藏日期2011年10月24日，保藏编号CGMCC No. 5381。本发明的另一个目的是提供一种基于WFYZH-Pro-0 -Iactam生产的能达到或超过国家检测标准的￠-内酰胺类抗生素残留快速检测试纸条。本发明的第一方面，提供了 WFYZH-Pro-0 -Iactam :将PBP Ib的第526位的异亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造为赖氨酸和精氨酸，制备原核表达载体转化大肠杆菌BL21制得阳性菌株(命名为WFYZH-Gchj-P-lactam，CGMCC No. 5381)进行表达，并通过分离纯化、活性测定和蛋白鉴定获得WFYZH-Pro- ^ -lactam。
本发明的第二方面,提供了一种基于WFYZH-Pro-0-lactam开发的￠-内酰胺类抗生素快速检测试纸条。在本发明实施例中，提供了基于WFYZH-Pro-P-Iactam加工试纸条的方法。
图I是WFYZH-Pro-@ -Iactam的对应基因测序结果。图2是WFYZH-Pro- ^ -Iactam的对应氨基酸测序结果。图3是试纸条示意图。
具体实施例方式本发明将PBP Ib的第526位的异亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造为赖 氨酸和精氨酸，并通过原核表达载体制备、表达纯化、活性测定、蛋白鉴定等，获得了WFYZH-Pro-P-Iactam，其与P -内酰胺类抗生素的亲和力大幅提高。I、基因定点突变根据所要突变位点的DNA序列设计两条突变引物(Ptl和Pt2)，与重组质粒PGEX-6p-l-PBP Ib引物(Pl和P2)配合进行3轮聚合酶链式反应(PCR)反应。第I轮PCR反应以重组质粒PGEX-6p-l-PBP Ib为模板，以Pl和Pt2搭配，扩增得到PBPIb基因5'端片段，以Ptl和P2搭配，扩增得到3'端片段，分别回收扩增产物备用。第2轮PCR反应以第I轮PCR反应得到的两个片段互为模板和引物作一次10个循环的扩增。第3轮PCR反应以第2轮PCR反应得到的产物为模板，Pl和P2搭配为引物再进行扩增，即可得到带有突变位点的目的基因，将其连接到载体(pGEM-T)中，转化鉴定后的阳性克隆进行测序，即可获得克隆载体(命名为pGEM-WFYZH)。2、原核表达载体构建用内切酶(XhoI和EcoRI)对pGEM_WFYZH与原核表达载体(pGEX-6p-l)分别进行双酶切，凝胶电泳后回收相应片段。在连接酶(T4DNA)的作用下将其连接，构建含目的基因的原核表达载体，转化大肠杆菌DH5 a恒温培养后，提取重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定正确后进行基因测序。测序结果表明(如附图1)，第526位异亮氨酸对应的碱基ata已经突变为aaa(赖氨酸)；第547位谷氨酰胺对应的碱基caa已经突变为cga (精氨酸)。3、蛋白的转化和表达自-70°C冰箱中取出含感受态大肠杆菌BL21 50 y L的I. 5mL离心管,插入湿冰中溶解约15min,向其中加入5 y L构建好的重组质粒,轻轻混勻后静置冰上30min。42°C水浴热激90s，迅速移入冰浴中静置2min，加入800iiL LB培养基(含15iig/mL四环素)，然后于37°C振荡培养(225rmp) lh，取50 y L培养物涂LB琼脂平板，于37°C培养12h ;挑选单菌落，用LB培养基振荡培养12h，提质粒，酶切鉴定，保存阳性克隆菌种。将阳性克隆菌种接种于5mL LB培养基中，于37°C、220rmp培养24h，培养物转接至IOOmL LB培养基，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 8，加入异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为lmmol/L，继续培养4h。采用4°C、6000rmp离心15min收获菌体。菌体重悬于磷酸缓冲液(PBS，0. Olmol/L)，菌体置冰浴中超声破碎。加入聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-IOO)至终浓度1%，室温搅拌30min，4°C、12000rmp离心15min，收集上清液。4、蛋白纯化以10倍体积的PBS和10倍体积的含1% Triton X-100的PBS平衡好的谷胱甘肽亲和层析柱，以20倍柱体积的PBS洗去杂蛋白，亲和柱中加入凝血酶，250C反应12h，收集酶切反应液，上样于经过lOmmol/L NH4HCO3预平衡的丙烯葡聚糖凝胶SlOO层析柱，以lOmmol/L NH4HCO3洗脱，收集洗脱液，浓缩。纯化后的WFYZH-Pro- ^ -Iactam储存在-20°C、10%的甘油溶液中。5、活性测定4°C条件下，向酶标板微孔中加入一定量WFYZH-Pro-P-Iactam溶液，放置过夜，以使蛋白固定于微孔表面，使用PBS冲洗微孔后，继续加入2%酪蛋白溶液封闭，使用PBS冲洗三次后备用。首先应该是配制含四种￠-内酰胺抗生素的牛乳样品(请添加)，向微孔中加入100 u L脱脂后的待测牛乳样品(做三个平行样)，37°C培养30min，使牛乳样品中含有的待测0 -内酰胺类抗生素与WFYZH-Pro-P -lactam充分反应，生成蛋白-待测抗生素复合物。向微孔中加入IOOii L生物素标记的氨苄青霉素(B-AMPI)，37°C培养30min，生成蛋白-B-AMPI复合物。用清洗溶液(8. 55g/L NaCl和0. 25mL/L Tween20)及PBS清洗两次后，向微孔中加入100 u L辣根过氧化物酶标记的亲和素(I 1500)，370C培养30min，以使蛋白-B-AMPI复合物与辣根过氧化氢酶标记的亲和素充分反应。使用清洗溶液和PBS冲洗微孔后，加入IOOii L辣根过氧化氢酶底物四甲基联苯胺溶液，37°C培养IOmin,向微孔中加入100 u L lmol/L盐酸溶液以终止酶解反应，并使用酶标仪测定微孔在 450nm处的吸光值。利用上述方法，分别测定改造前后PBP Ib和WFYZH-Pro- ^ -Iactam对于四种常用P-内酰胺类抗生素的检测极限(结果见下表)。表PBP Ib 和 WFYZH-Pro-P-Iactam 的活性对比结果
权利要求
1.一种高亲和力青霉素结合蛋白，其特征在干，所述蛋白基于无乳链球菌青霉素结合蛋白(PBP Ib)分子改造获得，其氨基酸序列为SEQ 2。
2.一种表达如权利要求I所述高亲和力青霉素结合蛋白的菌株，其保藏号为=CGMCCNo.5381。
3.ー种内酰胺类抗生素快速检测试纸条，其特征在于，该试纸条是基于权利要求I所述的高亲和カ青霉素结合蛋白生产获得。
4.根据权利要求3所述的β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条在用于快速检测β -内酰胺类抗生素的残留量的应用，其中所述的β_内酰胺类抗生素为具有β_内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素及单环β-内酰胺类抗生素等。
5.根据权利要求3所述的β_内酰胺类抗生素快速检测试纸条在快速检测农副产品中内酰胺类抗生素中的应用，其中所述的内酰胺类抗生素为具有内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素及单环β-内酰胺类抗生素等。
全文摘要
本发明提供了一种高亲和力青霉素结合蛋白，其特征在于，该蛋白是由无乳链球菌青霉素结合蛋白(PBP 1b)的第526位异亮氨酸和第547位的谷氨酰胺分别改造为赖氨酸和精氨酸后获得，提高了与β-内酰胺类抗生素的亲和力。本发明还提供了一种基于该蛋白生产的快速检测试纸条，可用于快速检测农副产品β-内酰胺类抗生素残留。
文档编号C12N1/21GK102627693SQ20121008910
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月30日 优先权日2011年11月22日
发明者侯伟, 周峰, 邢媛 申请人:平原县伟峰永驻科技有限公司