专利名称：一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株酿酒酵母工程菌，尤其涉及一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代谢途径的、能够快速代谢木糖的酿酒酵母工程菌株。
背景技术：
可替代石油基燃料和化学品生产技术的开发和储备是保障社会发展和国家安全的必要举措。年产量巨大的木质纤维素原料能够为大规模生物基相关产品生产提供物质基础，因而备受关注。木质纤维素中可利用糖的主要成分是葡萄糖及木糖，鉴于葡萄糖是容易利用的糖分，因此，含量可高达30%但不易利用的木糖的转化是原料充分利用的关键，也是降低生物基化学品生产成本的基础。目前从木糖衍生的产品主要是作为功能食品的木糖醇和木寡糖，及化学品糠醛，但这些产品一方面市场容量有限，另一方面只能依赖木糖含量较高的原料(如玉米芯)生产，因此急需开发葡萄糖、木糖共利用的大宗化学品生产平台以及相应的微生物细胞工厂。酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，人类对其的利用已有几百年的历史，因其良好的生产性能、对环境的高耐受性及公认的食品安全性而被认为是现代生物技术最有应用前景的微生物细胞工厂之一。但是，酿酒酵母因缺少木糖代谢途径而不能利用木糖。因此， 在酿酒酵母中构建木糖代谢途径模块，并进而建立目标产品的产出模块，将木糖转化为燃料或其他大宗化工品，对研究和发展以木质纤维素为原料化工产品生产平台具有重要的意义。在酿酒酵母中搭建的木糖代谢的研究工作已开展多年，主要策略是先将木糖转化成其异构体木酮糖，木酮糖再经过磷酸化这一限速步骤进入磷酸戊糖(PPP)途径，磷酸戊糖途径中间产物再通过糖酵解途径最终转化成丙酮酸并进一步代谢。途径繁琐且效率不高。首先，木糖转化成木酮糖的两条途径在酿酒酵母中的建立均存在局限性。①木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)催化的途径因XR和XDH辅助因子不偶联，造成引入该途径的菌株代谢木糖时氧化还原不平衡，由此造成副产物木糖醇积累的问题始终未能彻底解决； ②木糖异构酶(XI)途径虽然可以避开氧化还原不平衡的问题，但目前也仅有少数几种木糖异构酶在酿酒酵母中实现活性表达，且在酿酒酵母生长温度(30°C左右)下酶活不高，导致发酵过程木糖的转化效率不足。其次，木酮糖需要磷酸化成木酮糖-5-磷酸才能进入磷酸戊糖途径，控制催化这一反应的木酮糖激酶0 )的表达水平则成为另一瓶颈，研究表明 XK酶活低则表现木糖代谢效率不足，酶活高则由于消耗过多ATP而影响细胞生长。最后， 木酮糖-5-磷酸需要经磷酸戊糖途径再进入糖酵解途径才能转化成丙酮酸，磷酸戊糖途径的主要作用是在细胞内为许多大分子(如核酸)合成提供中间产物，可想而知，PPP的转化效率很难在保证自身大分子合成所需的基础上，再满足高效木糖分解代谢需要的代谢产物流量。为了提高酿酒酵母木糖代谢转化效率，很多工作围绕上面三个问题展开研究，包括对代谢途径进行了强化和优化，全局性影响因素分析等。目前，相关的工作仍是研究热点。但能显著提高酿酒酵母木糖代谢转化效率的根本措施应该是避开磷酸戊糖途径。新近在大肠杆菌中建立的木糖代谢途径引起我们的注意。这一途径中，一分子木糖经木糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸两个中间代谢产物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛(图I)。从代谢途径上看，这条通过木糖酸的木糖代谢途径大大缩短木糖到丙酮酸的距离(图1)，不与合成途径竞争，是一种经济节能的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代谢途径的、能够快速代谢木糖的酿酒酵母工程菌株。本发明所述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株，其特征在于所述菌株为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) BSHH02B,该菌已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5747。上述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株带有木糖代谢途径，S卩(I)木糖在木糖脱氢酶的催化下生成木糖酸；(2)木糖酸在木糖酸脱水酶催化下生成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸；
(3)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸在2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶催化下丙酮酸和乙醇醛。该菌株还带有未解析的乙醇醛代谢途径，可以进一步利用生成的乙醇醛。上述的酿酒酵母菌株的好氧发酵的特征如下在木糖(20g/L)为唯一碳源的全合成营养缺陷型液体培养基SC-ura上的最大比生长速率为O. 361Γ1 ;接种后28小时可收获14g/L菌体干重的最大酿酒酵母生物量，并在 28小时内将木糖利用完全；15小时后会积累少量的木糖醇，并在接种后21小时达到最大值
O.44g/L ;好氧条件下，不积累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。相应的出发菌株CEN. PK102-5B (Dr. Peter kotter赠送)不能利用木糖生长。本发明所述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是(I)表达载体构建将木糖脱氢酶基因Cc-xylB (Gene ID :7329904)、木糖酸脱水酶基因Ec-yjhG(Gene ID :7438120)和2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因Ec_yjhH(Gene ID :7438121)分别连接在附加体质粒pJFE3上，形成质粒pJFE3_XylB、pJFE3_yjhG和 pJFE3-yjhH ；以pJFE3_yjhH为模板，将Ec-yjhH基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒pJFE3-yjhG上，形成质粒PJFE3-yjhG-yjhH ；以pJFE3-xylB为模板，将 Cc-xylB基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒pJFE3-yjhG-yjhH上，形成质粒 pJFE3-yjhG-yjhH-xylB ；(2)通过醋酸锂转化法将步骤(I)中构建的表达载体pJFE3-yjhG-yjhH_xylB转化到酿酒酵母菌株CEN. PK102-5b中；在20g/L木糖为唯一碳源的SC-Ura培养基中测试其利用木糖的性能，筛选获得能够代谢木糖的酿酒酵母菌株。上述的木糖脱氢酶基因(Cc-xylB)来源于新月杆菌(Caulobacter crescentus)； 上述的木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)来源于大肠杆菌(Escherichia coli);上述的 2-酮-3-脱氧木糖酸醒缩酶基因(EC-yjhH)来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。上述构建表达载体所用的附加体质粒PJFE3是现有技术中已有的，该质粒已在山东大学硕士学位论文“不同来源木糖异构酶基因xylA的克隆、分子改造及在酿酒酵母木糖代谢工程中的应用”(葛瑞蕾，2011)公布，质粒PJFE3的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。上述的木糖代谢途径在酿酒酵母中的功能表达为世界首次；与其他酿酒酵母菌株所含有的木糖代谢途径相比，本发明所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BSHH02BCGMCC No. 5747菌株所含有的木糖代谢途径具有代谢途径短、不参与PPP途径、经济高效等优点，在好氧条件下，该菌株能够快速的利用木糖进行生长；能够应用于利用含木糖的原料生产化工产品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。
本发明所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BSHH02B 已于 2012 年 02 月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为 CGMCCNo. 5747，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究。图I是菌株BSHH02B代谢木糖的示意图，其中，一分子木糖经木糖酸、3_脱氧-D-甘油-戊酮糖酸两个中间代谢产物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛，并进一步代谢。图2是酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3_y jhG-y jhH-xylB示意图，其中木糖脱氢酶基因(Cc-xylB)来源于新月杆菌(Caulobacter crescentus),木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)来源于大肠杆菌(Escherichia coli), 2_酮_3_脱氧木糖酸醒缩酶基因 (Ec-yjhH)来源于大肠杆菌(Escherichia coli);并且以上三种基因都在酿酒酵母组成型启动子TEFlp控制下表达。图3是质粒pJFE3_xylB示意图,其中木糖脱氢酶基因(Cc-xylB)来源于新月杆菌 (Caulobacter crescentus),且此基因在组成型启动子TEFlp控制下表达。图4是质粒pJFE3_yjhG示意图,其中木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)来源于大肠杆菌(Escherichia coli),且此基因在组成型启动子TEFlp控制下表达。图5是质粒pJFE3_yjhH示意图，其中2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因(Ec-yjhH) 来源于大肠杆菌(Escherichia coli),且此基因在组成型启动子TEFlp控制下表达。图6是质粒pJFE3-yjhG_yjhH示意图,其中木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)来源于大肠杆菌(Escherichia coli), 2_酮_3_脱氧木糖酸醒缩酶基因(Ec-yjhH)来源于大肠杆菌(Escherichia coli);并且以上两种基因都在各自的同一种组成型启动子TEFlp控制下表达。图7是菌株BSHH02B在木糖(20g/L)为唯一碳源的全合成营养缺陷型培养基 SC-Ura上的生长曲线及代谢产物分析图。BSHH02B在木糖(20g/L)为唯一碳源的全合成营养缺陷型液体培养基SC-ura上的最大比生长速率为0. 361Γ1 ;接种后28小时可收获14g/L 菌体干重(▲)的最大酿酒酵母生物量，并在28小时内将木糖( )利用完全；15小时后会产生少量的木糖醇(■)，并在接种后21小时达到最大值0. 44g/L ;在整个好氧发酵过程中，不积累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I :重组质粒的构建方法如下(I)根据新月杆菌(Caulobacter crescentus)的木糖脱氢酶基因(Cc-xylB)序列人工合成其DNA ;并以此DNA为模板，以XF (XF的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)5’_ GTACGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCC-3'和 XR(XR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 3 所示)5' -TGACCTGCAGTCAACGCCAGCCGGCGTCG-3'为引物扩增Cc-xylB片段；随后利用限制性内切酶 BamHI和PstI对此扩增片段进行限制性酶切，并连接于附加体质粒pJFE3的TEFlp启动子和PGKlt终止子之间(利用限制性内切酶BamHI和PstI对pJFE3进行限制性酶切)，形成质粒 pJFE3-xylB(图 3)。上述pJFE3(2)以大肠杆菌(Escherichia coli)染色体为模板，以GF(GF的核苷酸序列如SEQ ID 吣.4所示)5' -CAGGTCTAGAAGGAGAAACTCATGTCTGT-3'和 GR(GR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示)5' -CATTCTGCAGGTCGGATAATTCAGGTGTCT-3'为引物扩增木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)片段；随后利用限制性内切酶XbaI和PstI对此扩增片段进行限制性酶切，并连接于附加体质粒PJFE3的TEFlp启动子和PGKlt终止子之间(利用限制性内切酶XbaI 和PstI对pJFE3进行限制性酶切)，形成质粒pJFE3-yjhG(图4)。(3)以大肠杆菌(Escherichia coli)染色体为模板，以HF (HF的核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示)5' -GTCAAGATCTATGAGCACTTACGAAAAGGA-3'和 HR(HR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 7 所示)5' -GATCCTGCAGTCAGACTGGTAAAATGCCCT-3'为引物扩增 2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因(Ec-yjhH)片段；随后利用限制性内切酶BglII和PstI对此扩增片段进行限制性酶切，并连接于附加体质粒PJFE3的TEFlp启动子和PGKlt终止子之间(利用限制性内切酶BamHI和PstI对pJFE3进行限制性酶切)，形成质粒pJFE3_yjhH(图5)。 (4)以质粒pJFE3_y jhH为模板，以PHF (PHF的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示) 5' -GTCTGAGCTCAACGAACGCAGAATTTTCGA-3'和 PHR(PHR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 9 所示)5 ' -CATCGAGCTCCACAATGCATACTTTGTACG-3 '为引物，将 Ec-yjhH 连同它的上下游 TEFlp启动子和PGKlt终止子一同PCR扩增，连接于pJFE3_yjhG质粒的SacI酶切位点上， 形成质粒 pJFE3-yjhG-yjhH(图 6)。(5)以质粒pJFE3-χylB为模板，以PBF(PBF的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示) 5 ' -GTCTCATATGAACGAACGCAGAATTTTCGA-3 '和 PBR (PBR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 11 所示):5 ' -CATCCATATGCACAATGCATACTTTGTACG-3 '为引物，将 Cc-xylB 连同它的上下游 TEFlp启动子和PGKlt终止子一同PCR扩增，连接于pJFE3-yjhG_yjhH质粒的NdeI酶切位点上，形成质粒 pJFE3_yjhG-yjhH_xylB(图 2)。实施例2 :重组菌株的构建(I)接CEN. PK102-5B菌株在YPD培养基，30°C培养过夜；(2)转接过夜培养的CEN. PK102-5B培养液到50ml新鲜YPD中，使初始OD6tltl等于
O.25，继续30°C培养约4小时，使培养液OD600等于O. 7至I. O ;(3)将质粒pJFE3_y jhG-y jhH-xylB用醋酸锂转化法转化CEN. PK102-5B菌株，其中，50%的聚乙二烯(PEG)3350用作保护剂，单链鱼精DNA用于质粒转化的担体。(4)转化后的菌悬液涂布添加20g/L葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura平板，挑取转化子。(5)转化子在20g/L木糖为唯一碳源的SC-Ura培养基中测试其利用木糖的性能， 筛选获得能快速利用木糖的酿酒酵母菌株BSHH02B。
上述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BSHH02B 已于 2012 年 02 月 08 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5747， 保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究。实施例3 BSHH02B菌株的木糖发酵方法如下(I)菌株活化挑取BSHH02B菌株的单菌落接种于添加20g/L葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura中，30°C、200rpm培养24小时；上述培养物以10%体积的接种量转接于全合成营养缺陷型培养基SC-Ura (20g/L葡萄糖作为碳源)中，30°C、200rpm培养12 小时。(2)接种将以上活化的菌液作为菌种，无菌水冲洗后以初始OD6tltl = O. I接种于含 800ml的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura (20g/L木糖作为碳源)的IL发酵罐中；在30°〇、 pH 5. 0,0. 5L/min的通气量、600rpm的搅拌转速的条件下进行发酵。(3)生长曲线的测定接种后，每隔一段时间取一定量的发酵液，测定菌液的0D_ 值，并计算比生长速率和获得的生物量(对该菌株，经测定，每单位OD6c 值相当于O. 2457g/ L的细胞干重)。BSHH02B在木糖(20g/L)为唯一碳源的全合成营养缺陷型液体培养基 SC-ura上的最大比生长速率为O. 36^1, 28小时可收获14g/L菌体干重的最大酿酒酵母生物量。(如图7)。相应的亲本菌株CEN. PK102-5B不能利用木糖生长。(4)代谢产物的分析将以上所取的发酵液13000rpm离心I分钟后，取上清液为高效液相色谱层析(HPLC)的分析样品，对其中的代谢产物(木糖、木糖酸、木糖醇、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸、乙醇)进行定量分析。分析过程中层析柱使用Aminex HPX-87H(Bio-Rad, USA)离子交换柱，检测器使用折光检测仪RID-10A (Shimadze，Japan)和二极管阵列检测器 SPD_M20A(Shimadze, Japan),流动相为 5mM H2SO4J^速为 O. 6ml/min,柱温为45°C。分析过程中所使用的层析柱不能将木糖和木糖酸有效的分离，木糖酸的定量还需使用Lien所建立的异羟肟酸比色法(1959):将上清液样品溶于O. 7M的HCl，100°C沸水浴15分钟将木糖酸转化为木糖酸-Y -内酯；取以上溶液125ul溶于250ul的羟胺试剂(2M 的羟胺盐酸溶于2M的NaoH)，随后依次加入162. 5ul的Hcl (3. 2M)和125ul的FeCl3(100g/ L，溶于O. IM的Hcl);最后，测定反应液在550nm处的吸光值。以上异羟肟酸比色法结合 HPLC即可计算出发酵液中木糖酸和木糖的含量。菌株BSHH02B在28小时内完全利用培养基中的木糖；15小时后开始积累少量的木糖醇，并在接种后21小时达到最大值O. 44g/L ； 在整个好氧发酵过程中，不积累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。本发明中使用的培养基配方YPD 培养基2%蛋白胨，I %酵母粉，2%葡萄糖，蒸馏水配制，自然pH值，115°C高温灭菌30分钟。SC-Ura 培养基I. 7g/L酵母基础氮源(YNB)，5. Og/L硫酸铵，O. 77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物， pH6.0，115°C高温灭菌30分钟。当补加碳源时，木糖或葡萄糖单独灭菌后加入，糖终浓度为 20g/L。
权利要求
1.一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株，其特征在于所述菌株为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BSHH02B,该菌已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5747。
2.权利要求I所述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是(1)表达载体构建将木糖脱氢酶基因Cc-xylB、木糖酸脱水酶基因Ec-yjhG和 2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因Ec-yjhH分别连接在附加体质粒pJFE3上，形成质粒 pJFE3-xylB、pJFE3_yjhG 和 pJFE3_yjhH ；以 pJFE3_yjhH 为模板，将 Ec-yjhH 基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒PJFE3-y jhG上，形成质粒pJFE3_y jhG_y jhH ； 以pJFE3-xyIB为模板，将Cc_XyIB基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒 pJFE3-yjhG-yjhH 上,形成质粒 pJFE3-yjhG-yjhH_xylB ；(2)通过醋酸锂转化法将步骤(I)中构建的表达载体pJFE3-yjhG-yjhH_xylB转化到酿酒酵母菌株CEN. PK102-5B中；在20g/L木糖为唯一碳源的SC-Ura培养基中测试其利用木糖的性能，筛选获得能够代谢木糖的酿酒酵母菌株。
3.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述的木糖脱氢酶基因Cc-xylB来源于新月杆菌(Caulobacter crescentus)。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述的木糖酸脱水酶基因Ec-yjhG来源于大肠杆菌(Escherichia Coli)。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述的2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因 Ec-yjhH 来源于大肠杆菌(Escherichia Coli)。
全文摘要
本发明公开了一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株，所述菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSHH02B，该菌已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5747。该菌株搭载有一独特的木糖代谢途径，即一分子木糖经木糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸两个中间代谢产物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛。利用该木糖代谢途径，本发明所述酿酒酵母BSHH02B能够在好氧条件下快速的利用木糖进行生长，并能够应用于利用含木糖的原料生产化工产品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。
文档编号C12N15/81GK102604850SQ20121008813
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者刘怀伟, 沈煜, 霍文严, 鲍晓明 申请人:山东大学