专利名称：利用酒糟发酵生产乙偶姻和转化生产四甲基吡嗪的方法
技术领域：
本发明涉及一种以酒糟为原料，通过微生物发酵生产乙偶姻和转化生产四甲基吡嗪的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
食品添加剂产业是现代食品工业的核心组成，在食品工业的产业升级中发挥着极其重要的作用。目前，全球各类食品添加剂的总消费量已接近1000万吨，品种有25000多种，而香精和香料则是其中用量最大、种类最多的一类食品添加剂。目前，在人们对食品添加剂营养、健康、安全性的强烈要求下，采用工业生物技术开发绿色、安全的香精香料等食品和饲料添加剂已成为该行业实现可持续发展的重要途径，对于催生我国高效、安全、健康、天然的香精香料产业，带动我国食品行业整体水平的发展，具有极其重要的意义。乙偶姻，即3-羟基-2-丁酮，天然存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草莓、可可等各类食品中，是一种应用广泛的食用香料，其具有明显的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、酸奶等香料的生产。国家标准GB2760-86规定其为容许食用的香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。此外，乙偶姻作为一种平台化合物，广泛应用于食品、制药、化工、IT等行业。乙偶姻的生产方法主要分为两类化学合成法与生物合成法。化学法生产乙偶姻存在着产品收率低、高能耗、高污染、且产品质量难以达到食用香料的要求。生物合成法生产的乙偶姻，有效地避免了上述问题，产品绿色天然、反应条件温和、污染少、能耗低，是一种十分具有发展前景的合成方法。目前有应用微生物采用合成培养基液态发酵生产乙偶姻的方法，但是存在原料成本高，发酵废液处理等问题。至今还没有采用酒糟等作为原料培养基进行固态发酵生产乙偶姻的报道。四甲基吡嗪，是吡嗪环碳原子上均连接甲基的含氮杂环化合物。四甲基吡嗪具有烘烤、花生、榛子、可可香气，被广泛用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配；同时，四甲基吡嗪作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等药理作用，现已广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾小球疾病等的治疗。四甲基吡嗪的生产方法可分为生物合成转化法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。其中，直接萃取法存在原料供应问题，化学法存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不属于‘天然’或‘生物合成’范畴。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物工程的手段生产四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点而广受消费者关注。目前有报道采用大豆来固态发酵生产四甲基吡嗪的方法，但是该法不但所用原料为粮食性作物，而且具有较高的原料成本；并且该法中需要添加大量的前体乙偶姻，由于乙偶姻属于较为昂贵的生物香料，因此通过添加外源前体乙偶姻的方法经济价值较低，难以实现工业化生产水平。2011年中国白酒产量1055万吨，产生酒糟四千多万吨。酒糟中含有大量的淀粉(10%)，粗蛋白(7%-10%)和微生物，氨基酸，有机酸，离子等营养成分。当前酒糟的处理方式是直接用来做饲料，但是该应用的附加值极低，其中大部分的营养成分均未有效开发与利用。因此，有效开发利用酒糟，生产高附加值物质，不仅能减少酒糟对环境的污染，还能带来巨大的经济效益。目前报道的利用酒糟的技术主要有烘干去稻壳直接生产饲料；经微生物发酵生产菌体蛋白饲料；进行固态发酵，生产酶类饲料添加剂；厌氧发酵生产沼气；也有利用酒糟的水解液发酵生产丁二酸的报道，但这属于液态发酵，且需要对酒糟进行水解，该过程不但复杂，而且液态发酵也存在废水污染等问题等。而对于利用酒糟为原料直接固态发酵生产生物香料入乙偶姻和四甲基吡嗪的报道目前没有报道。由于四甲基吡嗪可由前体物乙偶姻和铵盐反应生成，因此可通过在发酵产物中是否添加铵盐来有选择的控制生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的生产，具有重要的应用价值。
发明内容
I)要解决的技术问题
本发明要解决的一个技术问题是提供了一种以酒糟为原料生产生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法；本发明提供的另一个技术问题是提供了一种通过是否添加铵盐来有选择的生产乙偶姻或四甲基吡嗪的方法。(2)本发明的技术方案 乙偶姻的发酵生产
培养基的制作新鲜酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液调节酸度为O 5，补充葡萄糖O 100g/kg酒糟。菌株种子培养物枯草芽孢杆菌UaciBw1S subtilis、Q￡K￡ NO M208157和地衣芽孢杆菌licheniformis ) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC 3963 中任一株，以液体或固体麸皮培养基，挑取一环菌株接种，37°C培养16 48h。所述枯草芽抱杆菌{Bacillus subtil is、CCTCC NO M 208157已在申请号200810235366. 1，申请日2008年12月8日，发明名称“一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法”中公开。所述地衣芽孢杆菌UaciBw1S licheniformis) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC3963已在申请号201010238685. 5，申请日2010年7月28日，发明名称“一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株”中公开。液体种子培养基以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取液体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷却后加入糖化酶10 50单位/g原料，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节pH为4 6。固体种子培养基选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取固体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。乙偶姻的固体酒糟发酵条件液体种子培养基按2% 10%(v/w)接种,或固体种子培养基按2% 10% (w/w)接种，37°C培养I 3d，即可大量发酵产生乙偶姻。四甲基吡嗪的发酵生产培养基的制作新鲜酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液调节酸度为O 5，补充葡萄糖O 100g/kg酒糟菌株种子培养物枯草芽孢杆菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢杆菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液体或固体麸皮培养基，挑取一环菌株接种，37°C培养16 48h。液体种子培养基以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取液体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷却后加入糖化酶10 50单位/g原料，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节pH为4 6。固体种子培养基选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取固体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。四甲基吡嗪的固体酒糟发酵转化条件液体种子培养基按2% 10%(v/w)，或固态种子培养基2% 10% (w/w)接种，接种后，37°C培养I 3d后；补加铵盐10 30g/kg酒糟，包括磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、柠檬酸铵、硫酸铵、碳酸氢铵中的一种，四甲基吡嗪转化生产条件为30 90°C反应I 3d。上述所述的酒糟为酿造废弃的黄酒酒糟或白酒酒糟。酒糟发酵产生的乙偶姻的提取方法
固态发酵培养物按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超声保持lh，浸出液离心或过滤，所得上清液经减压蒸馏，控制温度为50-80°C，除去不挥发性杂质；收集馏分经50 80°C二次减压蒸馏除去水分，得到液态乙偶姻产物。酒糟发酵转化产生的四甲基吡嗪的提取方法
固态发酵培养物，按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超声保持lh，浸出液离心或过滤，所得上清液经减压蒸馏，控制温度为50-80°C，除去不挥发性杂质；收集馏分经低温冷却，产物析出，得到四甲基吡嗪湿晶体，在冷冻干燥得到粉末状四甲基吡嗪结晶。(3)本发明的有益效果
本发明以酒糟为原料发酵生产生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪，具有以下的特点和优点(I)可通过是否添加铵盐来有选择的控制生产乙偶姻或四甲基吡嗪，在生物香料的生产方面具有重要的实际应用价值；(2)发酵培养基中除了添加葡萄糖外，不需要额外添加其它营养成分，能够尽可能充分的有效利用酒糟中的营养成分，对于资源的有效回收利用具有重要的价值；(3)利用酒糟发酵生产乙偶姻或四甲基吡嗪，能够有效提高酒糟的附加值；(4)利用酒糟固态发酵生产乙偶姻或四甲基吡嗪，相对于液态发酵酒糟具有节省能源、减少废水污染的实用价值。本发明生产的乙偶姻浓度能够达到13.42g/kg酒糟；生产四甲基吡嗪的浓度能够达到3. 02 g/kg酒糟。
图I.枯草芽孢杆菌CCTCC NO :M208157利用白酒糟发酵生产乙偶姻转化生产四甲基吡嗪的时间曲线图。图2.地衣芽孢杆菌CGMCC 3961利用白酒糟发酵生产并提纯的产物乙偶姻和四甲基吡嗪的气相色谱图。图3.乙偶姻的离子碎片图。图4.四甲基吡嗪的离子碎片图。
具体实施例方式实施例I.黄酒糟发酵生产乙偶姻
培养基的制作新鲜酒糟加入NaOH溶液调节酸度为O 5，补充葡萄糖O 100g/kg。 菌株种子培养物枯草芽孢杆菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢杆菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液体或固体麸皮培养基，挑取一环菌株接种，37°C培养16 48h。液体种子培养基以白酒酿造所用的原料为培养基成分，选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制取原料液体培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷却后加入糖化酶10 50单位/g原料，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节pH为4 6。固体种子培养基选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : O. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino乙偶姻的固体酒糟发酵条件液体种子培养基按2% 10%(v/w)，或固态种子培养基2% 10% (w/w)接种，接种后，37°C培养I 3d，即可发酵产生乙偶姻13. 42g/kg。实施例2白酒糟发酵转化生产四甲基吡嗪
培养基的制作新鲜酒糟加入NaOH调节酸度为O 5，补充葡萄糖O 100g/kg。菌株种子培养物枯草芽孢杆菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢杆菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液体或固体麸皮培养基，挑取一环菌株接种，37°C培养16 48h。液体种子培养基以白酒酿造所用的原料为培养基成分，选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制取原料液体培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷却后加入糖化酶10 50单位/g原料，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节pH为4 6。固体种子培养基选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制作方式为原料样品经粉碎后，与水按I : 0. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino四甲基吡嗪的固体酒糟发酵转化条件液体种子培养基按2% 10%(v/w)，或固态种子培养基2% 10% (w/w)接种，接种后，37°C培养I 3d后，补加铵盐20g/kg酒糟，包括磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、柠檬酸铵、硫酸铵、碳酸氢铵中任一种，四甲基吡嗪转化生产条件为55°C反应I 3d，生成四甲基吡嗪3. 02g/kg酒糟。
实施例3白酒糟发酵生产乙偶姻的提取 Ikg固态发酵培养物，按照I: I 2 (w/v)加入蒸馏水，置于60°C水浴中超声lh，浸出液SOOOrpm离心lOmin，所得上清液经70°C减压蒸馏除去不挥发性杂质；收集馏分经80°C二次减压蒸馏除去水分，得到液态乙偶姻产物9. 6mL。实施例4四甲基吡嗪提取方式
Ikg固态发酵培养物，按照1:1 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超声保持lh，浸出液SOOOrpm离心lOmin，所得上清液经80°C减压蒸馏除去不挥发性杂质；收集馏分经4°C低温冷却，产物析出，得到四甲基吡嗪湿晶体，8000rpm，4°C离心lOmin，收集固体在冷冻干燥得到粉末状四甲基吡嗪结晶2. Og。
权利要求
1.一种以酒糟为原料有选择的控制发酵生产乙偶姻或转化生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于新鲜酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液调节酸度为O 5，补充葡萄糖O 100g/kg酒糟，加入菌株种子培养物发酵生产乙偶姻；在发酵产物中另外补充铵盐10 30g/kg酒糟，转化反应生产四甲基吡嗪； 所述的菌株种子培养物为枯草芽孢杆菌subtil is) CCTCC NO :M208157、地衣芽抱杆 1MiBacillus licheniformis') CGMCC 3961,地衣芽抱杆舊 QBacilluslicheniformis) CGMCC 3962,地衣芽抱杆菌 CfeciBw1S Iicheniformis) CGMCC 3963 中任一株，以液体或固体麸皮培养基，挑取一环菌株接种，37°C培养16 48h ； 液体种子培养基以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取液体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水w/v按I : I 4的比例混合后,蒸煮l-5h,冷却后加入糖化酶10 50单位/g原料,于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节pH为4 6 ; 固体种子培养基选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方制取固体种子培养基，制作方式为原料样品经粉碎后，与水w/v按I : O. 5 2的比例混合后，80 10CTC 蒸煮 30min ； 乙偶姻发酵生产条件为液体种子培养基按2% 10% v/w接种，或固体种子培养基按2% 10% w/w接种，37 °C培养I 3d ; 转化反应生产四甲基吡嗪的条件为30 90°C反应I 3d ; 所述补充铵盐包括磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、柠檬酸铵、硫酸铵、碳酸氢铵中的一种。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所用酒糟为酿造废弃的黄酒酒糟或白酒酒糟。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于发酵生产的乙偶姻的提取方法为，固态发酵培养物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超声保持lh，浸出液离心或过滤，所得上清液经减压蒸馏，控制温度为50 80°C，除去不挥发性杂质；收集馏分经50 80°C二次减压蒸馏除去水分，得到液态乙偶姻产物。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于转化生产的四甲基吡嗪的提取方法为，固态发酵培养物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超声保持lh，浸出液离心或过滤，所得上清液经减压蒸馏，控制温度为50 90°C，除去不挥发性杂质；收集馏分经低温冷却，产物析出，得到四甲基吡嗪湿晶体，经冷冻干燥得到粉末状四甲基吡嗪结晶。
全文摘要
本发明公开了以酒糟为原料，利用微生物发酵生产生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法，属于生物工程技术领域。本发明在经酸度调节的新鲜酒糟中补充适量葡萄糖0～100g/kg，加入枯草芽孢杆菌(CCTCCNOM208157)或地衣芽孢杆菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株培养的种子培养物后37℃发酵1～3天，能够大量产生生物香料乙偶姻。在此基础上，还可通过向上述发酵产物中添加铵盐来转化生产另一种生物香料四甲基吡嗪。本发明突出的优点是利用酒糟为原料，通过是否添加铵盐来有选择的控制生产生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪的方法，既可有选择的获得不同高附加值的生物香料，又防止了酒糟污染环境，提升了酒糟的利用价值。
文档编号C12P17/12GK102618587SQ20121008961
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者吴群, 徐岩 申请人:江南大学