专利名称：一种Cry1Ab/Ac转基因成分配对单克隆抗体制备及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体的制备，尤其是一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体制备及双抗夹心ELISA检测方法。
背景技术：
单克隆抗体技术是将骨髓瘤细胞和经某种抗原诱导产生的特异性B细胞经PEG等融合剂作用或电激光融合，形成杂交瘤细胞然后筛选分离出单个阳性杂交瘤细胞。再将其扩增最终分离，纯化抗体的过程。杂交瘤细胞具有双重特性既能如骨髓瘤细胞般持续繁殖，又能如B细胞一样分泌针对单一抗原表位的特异性抗体。单克隆抗体与抗血清又称多克 隆抗体(polyclonal antibody PcAb),主要区别是单克隆抗体是一种均一的免疫球蛋白分子，具有针对一个抗原决定簇的特异性；与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性如高特异性、高纯度、均质性好、重复性好、效价高、等优点，在医学治疗及诊断等有广泛应用。
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的选用6周龄的雌性BALB/c小鼠(4只)作为免疫动物，转基因蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后采用皮下多点注射(IOOyg/只)。间隔4周加强免疫，转基因蛋白与等量弗氏不完全佐剂乳化后多点皮下注射(100 μ g/只)，加强免疫2次。最后一次加强免疫后一周断尾采血，分离血清，以转基因蛋白为检测抗原测定小鼠血清抗体效价。细胞融合时提前3天用30 μ g抗原对融合小鼠进行加强免疫。选择状态良好的、对HAT敏感的SP2/0细胞株，免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按I : I混合，聚乙二醇-4000为融合剂，将融合好的细胞铺进96孔细胞培养板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液。用ELISA法(转基因蛋白为检测抗原)筛选阳性克隆孔，有限稀释法克隆3次至阳性率达到100%，细胞建株，扩大培养，并液氮冻存杂交瘤细胞株。取7周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.2mL。10天后腹腔接种一定数量的杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大，用弯头滴管采集腹水，间接ELISA测定腹水抗体效价。用HRP偶联抗体，从而进行抗体配对试验(I)称取4mg HRP溶于ImL纯水中，加入200 μ L IOOmM高碘酸钠(现配现用)，4°C搅拌20min，至溶液呈墨绿色；(2)将上述溶液置于ImM pH4. 4醋酸缓冲液中透析过夜；(3)用0. IM CB (碳酸盐缓冲液)调上述HRP溶液pH为9. O ;(4)将适量抗体加入HRP溶液中，4°C搅拌2h ；(5)继续加入100 μ L 4mg/ml硼氢化钠，4°C避光搅拌2h ；(6)使用pH 8. 5硫酸铵饱和溶液对以上溶液进行硫酸铵沉淀，离心之后管底所得褐色沉淀物即为实验所得抗体联酶。用ELISA的方法筛选出关于Bt CrylAb蛋白、BtCrylAc蛋白的配对抗体，其步骤为(I)将鼠单抗用pH9. 6的碳酸盐缓冲液按照I : 100倍稀释；(2) 10%羊血清封闭，每孔150 μ L，恒温37°C封闭3小时；(3)加入浓度为50ppb/0ppb的转基因Cry lAb、CrylAc抗原标准品，100 μ L/孔，37°C,温育 60min ；(4)用稀释液按 I : 100比例稀释酶标抗体D06-HRP、D07-HRP，充分混匀，37°C，温育 60min ；(5)显色反应，读取OD值。通过已找到的配对抗体来检测实际样品与添加样品，测试回收率。
图I为转基因蛋白标准工作曲线。
具体实施例方式以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。选用6周龄的雌性BALB/c小鼠(4只)作为免疫动物，转基因蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后采用皮下多点注射(IOOyg/只)。间隔4周加强免疫，转基因蛋白与等量弗氏不完全佐剂乳化后多点皮下注射(100 μ g/只)，加强免疫2次。最后一次加强免疫后一周断尾采血，分离血清，以转基因蛋白为检测抗原测定小鼠血清抗体效价。细胞融合时提前3天用30 μ g抗原对融合小鼠进行加强免疫。选择状态良好的、对HAT敏感的SP2/0细胞株，免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按I : I混合，聚乙二醇-4000为融合剂，将融合好的细胞铺进96孔细胞培养板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液。用ELISA法(转基因蛋白为检测抗原)筛选阳性克隆孔，有限稀释法克隆3次至阳性率达到100%，细胞建株，扩大培养，并液氮冻存杂交瘤细胞株。取7周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只小鼠O. 2mL。10天后腹腔接种一定数量的杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大，用弯头滴管采集腹水，间接ELISA测定腹水抗体效价。小鼠腹水离心15min(2000rpm，室温)，挑去上层油脂，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min,离心30min (13000rpm, 4°C ),弃上清；沉淀溶于适量PBS (O. OlM pH7. 4);在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min (13000rpm, 4°C )，弃上清；沉淀溶于适量PBS (O. 01M, pH7. 4)，4°C透析过夜，测定蛋白质含量，-20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后继续才有Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5mL0. 4M PB缓冲液(pH 7. O)平衡纯化小柱；抗体过柱,过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续IOmLO. 4M PB缓冲液(pH 7. O)平衡纯化小柱；5mL0. IM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 7.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入IM Tris-HCKpH 2. 7)中和甘氨酸，使PH保持为适合抗体保存的中性；IOmLO. 4M PB缓冲液(pH 7. O)平衡纯化小柱；5mL 20%乙醇溶液过柱，于4°C条件下保存纯化小柱。用HRP偶联抗体，进行抗体配对试验(I)称取4mg HRP溶于ImL纯水中，加入200 μ L IOOmM高碘酸钠(现配现用)，4°C搅拌20min，至溶液呈墨绿色；(2)将上述溶液置于ImM pH4. 4醋酸缓冲液中透析过夜；(3)用O. IM CB (碳酸盐缓冲液)调上述HRP溶液pH为9. O ;(4)将适量抗体加入HRP溶液中，4°C搅拌2h ；
(5)继续加入100 μ L 4mg/ml硼氢化钠，4°C避光搅拌2h ；(6)使用pH 8. 5硫酸铵饱和溶液对以上溶液进行硫酸铵沉淀，离心之后管底所得褐色沉淀物即为实验所得抗体联酶。用ELISA的方法筛选出关于Bt CrylAb蛋白、Bt CrylAc蛋白的配对抗体I.配置试剂(I)配置包被液将O. 3g NaC03和O. 58g NaHC03加双蒸水定容至100mL。(2)配置稀释液，配方如下
Na2HP04*12H203.35 g
NaH2P04*2H200.2 g
NaCl8.0 g
KCl0.2 g
Casein1.0 g
ddH20IOOOmL(3)配置洗涤液，配方如下
Na2HP04*12H203.35 g
MaH2P04*2H200.2 g
NaCl8.0 g
KCl0.2 g
Tween-202.0 mL
ddH20IOOOmL2.包被(I)将的鼠单抗(硫酸铵沉淀)用ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液(包被液，下同)按照I 100倍稀释，100 μ L/孔，4°C过夜。(2)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin。3.封闭(1)10%羊血清封闭(用PH9. 6的碳酸盐缓冲液按照I : 9倍稀释)，每孔150 μ L，恒温37°C封闭3小时。(2)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin。4 加样(I)加入浓度为50ppb/0ppb的转基因Cry lAb、CrylAc抗原标准品，100 μ L/孔，37°C,温育 60min。(2)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 μ L，时间为lmin。
5 加酶(I)用稀释液按I : 100比例稀释酶标抗体D06-HRP、D07-HRP，充分混匀，37°C，温育 60mino(2)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 μ L，时间为lmin。6显色反应、检测每孔加TMB 100uL，37°C反应15min，加入2M H2S04，100 μ L/孔，酶标仪测读数450mn读取OD (吸光度)值。7. ELISA 检测结果
(+ 代表f目号值强弱，+ f目号值 O. 2-0. 5，++0· 5-1. 0，+++I. 0-1. 5，++++I. 5 以上标记无区别说明空白值和阳性值基本无区别，标记空白高说明空白值偏高，但是与阳性值还是有区别，没标记无区别说明空白值与阳性值有明显区别，空白值在O. 2左右)
权利要求
1.一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，用转基因蛋白诱导6周龄的免疫雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选阳性克隆孔，细胞建株，扩大培养，液氮冻存杂交瘤细胞株，得到所需产物。
2.如权利要求I所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的制备方法，其特征在于，选用6周龄的雌性BALB/c小鼠作为免疫动物，转基因蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后采用皮下多点注射，100 μ g/只，间隔4周加强免疫，转基因蛋白与等量弗氏不完全佐剂乳化后多点皮下注射，IOOyg/只，加强免疫2次，最后一次加强免疫后一周断尾采血，分离血清，以转基因蛋白为检测抗原测定小鼠血清抗体效价。
3.如权利要求I所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的制备方法，其特征在于，杂交瘤细胞株的建立步骤为细胞融合时提前3天用30 μ g抗原对融合小鼠进行加强免疫，选择状态良好的、对HAT敏感的SP2/0细胞株，免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 按I : I混合，聚乙二醇-4000为融合剂，将融合好的细胞铺进96孔细胞培养板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液，用ELISA法筛选阳性克隆孔，有限稀释法克隆3次至阳性率达到100%，细胞建株，扩大培养，获得杂交瘤细胞株。
4.如权利要求I所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的应用,其特征在于，利用这种单克隆抗体通过双抗夹心ELISA检测技术检测实际样品与添加样品，测试回收率。
5.如权利要求4所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的应用，其特征在于，用HRP偶联抗体，用双抗夹心ELISA检测方法筛选出关于Bt CrylAb蛋白、Bt CrylAc蛋白的配对抗体。
6.如权利要求5所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的应用，其特征在于，双抗夹心ELISA检测方法步骤为 (1)将鼠单抗用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照I : 100倍稀释； (2)10%羊血清封闭，每孔150 μ L，恒温37°C封闭3小时； (3)加入浓度为50ppb/0ppb的转基因CrylAb、CrylAc抗原标准品，100μ L/孔，37°C，温育60min ； (4)用稀释液按I: 100比例稀释酶标抗体D06-HRP、D07-HRP，充分混匀，37°C，温育60min ； (5)显色反应，读取OD值。
7.如权利要求4所述的一种CrylAb/Ac转基因成分配对单克隆抗体的应用，其特征在于，通过已找到的配对抗体来检测实际样品与添加样品，测试回收率。
全文摘要
一种Cry1Ab/Ac转基因成分配对单克隆抗体制备及双抗夹心ELISA检测方法。用转基因蛋白诱导6周龄的免疫雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选阳性克隆孔，细胞建株，扩大培养，液氮冻存杂交瘤细胞株，得到所需产物。然后用HRP偶联抗体，用双抗夹心ELISA检测方法筛选出关于Bt Cry1Ab蛋白、Bt Cry1Ac蛋白的配对抗体，通过已找到的配对抗体来检测实际样品与添加样品，测试回收率。
文档编号C12R1/91GK102964447SQ20121008914
公开日2013年3月13日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者武爱波, 祝长青, 陶海强, 刘刚, 杨文杰, 刘木林, 徐伟, 钟国良, 黄明 申请人:无锡福阳生物科技有限公司, 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心