专利名称：环境中常见微生物pcr检测技术的前处理方法
技术领域：
本实发明涉及一种微生物的处理方法，具体涉及的是微生物PCR检测技术的前处
理方法。
背景技术：
在最近的研究中，通过PCR检测不同种类的微生物，对微生物进行直接定性测试已经是常见的研究方法，尤其是环境中常见的细菌等微生物，都需要对菌体进行24小时培养，整体检测时间需要I 2天。环境中常见的微生物有葡萄球菌属、链球菌属、沙门菌属、志贺菌属、霍乱、弧菌、 大肠杆菌等致病菌以及一些无致病功能的菌体。尤其是在牲畜养殖场的环境中，大肠杆菌、沙门菌属、葡萄球菌属等是最常出现的菌群，这些菌群出现在温血动物肠道中引起肠粘膜细胞水与电解质的代解紊乱，是导致幼畜腹泻的主要病因之一。这些菌群在牲畜中主要的传染途径是通过食入了被污染的饲料所致，由于养殖业的特点，饲料都是散放于养殖的环境中的，所以对环境中，特别是牲畜养殖场中的致病菌的及时、准确的检测就显得非常重要。聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction, PCR)是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术，能够快速、准确地在体外上百万倍的扩增目的基因或DNA片段。现在应用的PCR技术能在48h内实现对环境中常见致病菌的快速、准确检测， 结果与鉴别培养没有明显差异；但是在应对突发性病变时，这种技术需要依靠细菌培养和 DNA的提取，操作较复杂，耗时长。而且在PCR扩增过程中，样本中含有大量杂质，且细菌量在不同样本中的差别明显，直接检测可能出现严重的假阴性情况，干扰实验结果。同时，样本中DNA的质量在PCR检测中非常重要，除菌群浓度高低外，缓冲液中离子浓度也会对DNA 的质量造成影响，从而直接影响PCR的扩增结果。
发明内容
本发明提供一种无需经过DNA提取即可进行PCR检测，且可减少检测所需时间、简化检测步骤、提高PCR检测效率的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下
环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，主要由以下步骤构成
(1)获得样本；
(2)过滤将样本用双蒸水混匀后过滤，过滤后的液体再用滤纸过滤，得到过滤液；
(3)离心将过滤液于8500Xg 12000Xg的离心条件下离心；
(4)洗涤离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤；
(5)稀释采用磷酸盐缓冲液对洗涤后的沉淀进行稀释，稀释后菌液浓度不小于 I. 5X 103CFU/ml，稀释后的菌液即进行PCR检测。进一步，所述常见微生物为革兰氏阴性菌、葡萄球菌、链球菌或菌肺炎双球菌。
为了更好的实现本发明，所述磷酸盐缓冲液的浓度为O. 05M O. 2M。作为一种优选，所述样本米自养殖场环境中。作为最优的实施方式，所述步骤(5)中稀释后菌液浓度不小于3. 12X103CFU/ml。本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果
(1)本发明处理后获得的菌液，无需再经过培养基培养和DNA提取的过程，可直接进行 PCR检测，简化了检测步骤，减少实验所需时间，可在4小时内获得检测结果；
(2)本发明处理后的菌液与其他方法处理后的菌液相比，当其进行PCR检测时，其检测效率明显提闻；
(3)本发明采用8500Xg 12000Xg的离心条件离心，可保证有效的分离出致病菌；
(4)本发明采用双重过滤以及缓冲液洗涤沉淀的方法，可基本排除样本中影响PCR反应的影响因子，使检测结果更准确；
(5)本发明中稀释后的菌液浓度不小于I.5X103CFU/ml，保证有效的检测出扩增条带， 使检测的结果更准确；
(6)本发明采用浓度为O.05M O. 2M的磷酸盐缓冲液，有效避免磷酸盐缓冲液中的离子对DNA的质量造成影响。
图I为样本中大肠埃希菌的PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图2为纯的大肠埃希菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图3为样本热裂解法PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图4为样本细菌漂浮法PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图5为样本增菌后PCR扩增样本敏感性比较1%凝胶电泳图。图6为样本中猪霍乱沙门氏菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图7为样本中金黄色葡萄球菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。图8为样本中链球菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图
图9为样本中菌肺炎双球菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于下列实施例。实施例I
本实施例主要由以下步骤构成
(I)获得样本；即确定样本，本发明的样本为养殖场中的粪便，该样本采自四川省洪雅市两个不同的肉猪养殖场。(2)过滤将样本用双蒸水混匀后过滤，过滤后的液体再用滤纸过滤，得到过滤液； 即样本用双蒸水溶解，震荡混匀后，用钢网将混合物中的渣滓过滤掉，过滤后的液体再采用双层滤纸过滤，得到过滤液。(3)离心本实施例采用9000Xg的离心速度，对过滤液进行离心，离心的时间为 4min。
(4)洗涤离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤；本步骤中磷酸盐缓冲液采用的浓度为O. 1M，洗涤的次数为2次。(5)稀释采用磷酸盐缓冲液对洗涤后的沉淀进行稀释，稀释后菌液浓度不小于1.5X103CFU/ml，稀释后的菌液即进行PCR检测。在本实施例中，Ig样本提取出的菌体沉淀采用30ul的磷酸盐缓冲液对其进行稀释。经检测，稀释后浓度菌液浓度不小于 I. 5X103CFU/ml。PCR检测步骤
将13ul的MixDNA聚合酶、Iul的引物、Iul的菌液和IOul的ddH20的混合液加入到 PCR扩增仪中进行PCR扩增。以扩增后的产物作为样品，对10个样品进行检测，检测结果如图I。该引物的浓度为10pmol/ul,该MixDNA聚合酶采用天根生化科技有限公司 (tiangen)生产的 2x Taq MasterMix。本实施例PCR检测所采用的反应条件为941预变性41^11，941变性45s，55°C退火40s，72°C延伸45s，循环30次。扩增后产物用I. 0%的凝胶进行电泳。根据检测的菌种不同，检测该菌种时所采用的引物也就不相同，引物采用的是本领域的技术人员公知的可检测出该菌种的引物。本实施例以检测肠毒素大肠杆菌为目的， 具体检测的是大肠埃希菌，该菌的纯菌购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC197。本实施例所采用的引物与大肠埃希菌相匹配。对照实验
I、纯的大肠埃希菌的敏感度的检测取大肠埃希菌的纯菌，用牛肉膏培养基作为稀释液，梯度稀释后，检测在10' 10_3，10_5，10_7，10_9浓度下，分别取10_5，10_7，10_9进行菌液涂板，每个稀释度平行涂3板，37°C培养24小时后进行菌落计数，计算出细菌原液浓度。对菌液采用直接PCR反应，计算出检出限；即分别取不同稀释浓度下的大肠埃希菌的菌液Iul为模版，在IO-1，10Λ 1(Γ5，10' IO-9的浓度下进行PCR扩增，扩增后检测结果见图2。2、细菌热裂解法取样本lg，用5ml浓度为O. IM的磷酸盐缓冲液溶解该样本，震荡混匀30s，使用过滤钢网简单过滤杂质，过滤后所得液体煮沸5分钟，500Xg的条件下离心4min，取上清液。用lul、5ul、10ul分别进行PCR检测。本对照例中进行检测的样品数为十个，该十个样本中包括Iul的样本3个、5ul的样本4个、IOul的样本3个，检测结果如图3。3、细菌漂浮法取样本lg，20ml双蒸水溶解，震荡混匀30s。在500Xg的条件下离心4min，取上清于新的50ml无菌离心管中，重复操作二次。在9000Xg的条件下离心4 分钟，弃上清液，收集沉淀。收集的菌体用30ml浓度为O. IM的磷酸盐缓冲液悬浮，9000 X g 离心、洗涤2次，洗净的菌体悬浮在3 ml的TE Buffer中，用枪吹打后涡旋振荡均匀，本对照例中，以振荡均匀后的菌体作为样品进行PCR检测。样品数为十个，检测结果如图4。4、直接检测对照取样本lg，用Iml的磷酸盐缓冲液溶解，充分混匀后，分别取 lul、5ul、10ul的混匀液作为样品进行PCR检测分析。本对照例中样品数为十个，该十个样本中包括Iul的样本3个、5ul的样本4个、IOul的样本3个。5、增菌后PCR扩增样本敏感性检测取样本lg，用Iml的磷酸盐缓冲液溶解，取IOul溶解后的标准样本,加入到5ml牛肉膏培养基中，培养16小时后，取培养后的液体 Iul作为样品进行PCR扩增检测。本对照例中样品数为6个，检测结果如图5。结果分析
如图I所示，通过本发明处理后的10个样本，有6个样本检测出目的条带，通过2次 PCR检测，发现依然有6个样本能出现目的条带。说明本发明能达到实验检测大肠埃希菌的目的，通过2次过滤，洗涤，可有效将影响PCR反应的影响因子基本排除。如图2所示，图中从左到右扩增条带的浓度顺次为10'10'10'10'ΚΓ1，浓度为10_7的扩增条带后均出现了与理论值大小相符条带(487bp)。其结果表明在10_7，也就是每毫升菌液浓度达到3. 12X103 CFU/ml时，能扩增出理论相符的条带。即该方法的敏感性可达 I. 5X103CFU/ml。如图3所示，在细菌热裂解法中对10个样本进行了 PCR检测分析，在反应模版分别为lul，5ul，10ul的情况下，只在2个样本中出现了与理论值大小相符的目的条带，该目的条带均出现在模版为5ul时。经过2次PCR反应，在另一个样本的5ul条件下也出现了目的条带。实验部分检出条带，说明此方法可以分离出菌体，具有一定的效果。同样的样本， 5ul能检测出结果，而IOul无法检测出，说明菌液中存在其他物质，该物质是导致检验结果出现假阴性的主要原因。此方法在结果准确性方面与检测的需求差距较大，样本中存在某些物质可能对PCR扩增结果存在有较大干扰。如图4所示，通过细菌漂浮法处理的10个样本，经过PCR扩增、电泳检测后发现均没有目的条带出现，后通过超速离心进行菌体富集，将3ml的结果通过高速离心，将细菌重新用30ul体积的磷酸盐缓冲液漂浮，在3个样本中检测出了目的条带，二次PCR没有新的结果出现。有上述结果可知此方法对菌体损耗大，大量细菌在处理过程中丢失，菌体浓度无法达到实验检测要求。在直接检测对照中，直接对照检测的10个样本，扩增后都未出现目的条带。说明 其中的某些因素，严重影响PCR反应的条件，出现假阴性结果。如图5所示，所得的6个样本在PCR扩增后都能取得清晰一致的目的条带，与本发明一致，说明本发明的方法符合检测的目的需求，在检出限范围内，能获得预期的结果。实施例2
本实施例与实施例I的不同点在于样本的选择、离心条件以及检测的菌种。本实施例中样本选择为散放于养殖场环境中的饲料，离心条件采用8500 X g，检测的菌种为猪霍乱沙门氏菌。该猪霍乱沙门氏菌为革兰氏阴性菌。其PCR检测结果如图6。实施例3
本实施例与实施例I的不同点在于样本的选择、离心条件以及检测的菌种。本实施例中样本选择为养殖场环境中的垫料，离心条件采用9500Xg，检测的菌种为金黄色葡萄球菌。其PCR检测结果如图7。实施例4
本实施例与实施例I的不同点在于样本的选择、离心条件以及检测的菌种。本实施例中样本选择为养殖场环境中的生活污水，离心条件采用9300Xg，检测的菌种为链球菌。
其PCR检测结果如图8。实施例5
本实施例与实施例I的不同点在于样本的选择不同，样本的选择、离心条件以及检测的菌种。本实施例中样本选择为养殖场周边的土壤，离心条件采用8800Xg，检测的菌种为菌肺炎双球菌。其PCR检测结果如图9。在图6 图9中，目的条带均被检测出，根据以上检测结果，则可有效的证明使用本发明所述的前处理方法处理后，环境中常见微生物均能够有效的被检测出来。按照上述方法，便可很好地实现本发明。
权利要求
1.环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，其特征在于，主要由以下步骤构成(1)获得样本；(2)过滤将样本用双蒸水混匀后过滤，过滤后的液体再用滤纸过滤，得到过滤液；(3)离心将过滤液于8500Xg 12000Xg的离心条件下离心；(4)洗涤离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤；(5)稀释采用磷酸盐缓冲液对洗涤后的沉淀进行稀释，稀释后菌液浓度不小于I.5X103CFU/ml ;稀释后的菌液即进行PCR检测。
2.根据权利要求I所述的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，其特征在于 所述常见微生物为革兰氏阴性菌、葡萄球菌、链球菌或菌肺炎双球菌。
3.根据权利要求2所述的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，其特征在于 所述磷酸盐缓冲液的浓度为O. 05M O. 2M。
4.根据权利要求3所述的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，其特征在于 所述样本米自养殖场环境中。
5.根据权利要求2或3或4所述的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，其特征在于所述步骤(5)中稀释后菌液浓度不小于3. 12X103CFU/ml。
全文摘要
本发明公开了环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，本发明主要由以下步骤构成(1)获得样本；(2)过滤将样本用双蒸水混匀后过滤，过滤后的液体再用滤纸过滤，得到过滤液；(3)离心将过滤液于8500×g～12000×g的离心条件下离心；(4)洗涤离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤；(5)稀释采用磷酸盐缓冲液对洗涤后的沉淀进行稀释，稀释后菌液浓度不小于1.5×103CFU/ml；稀释后的菌液即进行PCR检测。本发明具有无需经过DNA提取即可进行PCR检测、可减少检测所需时间、简化检测步骤、提高PCR检测效率等优点。
文档编号C12R1/42GK102605087SQ20121009000
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者叶勇刚, 廖党金, 曹冶, 李江凌, 王秋实, 罗丹丹, 谢晶, 赵素君 申请人:四川省畜牧科学研究院