专利名称：柑橘黄龙病的lamp快速检测方法
技术领域：
本发明属于一种环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)分子检测方法，特别涉及一种柑橘黄龙病的LAMP快速检测方法。
背景技术：
柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是世界柑橘业最具毁灭性的病害之一，是国内外植物检疫对象。该病害在我国主要由韧皮部杆菌属细菌的亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)引起。特征性病状是病树的“黄梢”和叶片的斑驳型黄化；果实小，畸形，严重影响柑橘的品质与产量。目前由于缺乏有效药剂和抗病品种，主要采取砍除病树、防治木虱和种植无病苗木的的防治方法，因此加强柑橘黄龙病的早期诊断显得尤为重要。由于传统的指示植物诊断、电镜检测和免疫学检测方法不仅费时费力，而且检测效率低；近年来，聚合酶链式反应(PCR)已应用到柑橘黄龙病的检测上，但是PCR检测技术需要特殊仪器设备且检测成本较高，不适合在田间大规模快速应用，因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切需要一种成本低廉、简便、快速、灵敏和特异的柑橘黄龙病快速检测方法。LAMP是由Notomi于2000年开发的一种新型的核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩增。它避免了常规PCR温度循环的特殊要求，并且因其高效性、 简易性、成本低廉且检测周期短等特点，又在另一层面上提高了它的应用价值。现已运用的领域主要集中在植物病毒和转基因食品的检验检疫工作中，在细菌、真菌、线虫和昆虫的检验检疫工作相关报道相比甚少，因而有较大的开拓空间，LAMP检测技术将会在植物检疫领域发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种灵敏度高、特异性强、不需要电泳及特殊仪器的柑橘黄龙病LAMP快速检测方法，用于柑橘黄龙病的田间早期诊断。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种柑橘黄龙病的LAMP快速检测方法，包括用于检测柑橘黄龙病的LAMP扩增特异性引物组，分别为omp-FIP5' -GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAAT-3'omp-BIP5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTC AGA-3;omp-F3 5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3'omp-B3 5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3'。本发明利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩增，建立了简便、快速、灵敏度高和特异性强的HLB环介导等温扩增(LAMP)检测方法，便于在田间大规模快速应用。本发明的柑橘黄龙病LAMP检测方法按照如下步骤完成(I)柑橘黄龙病病叶总DNA提取，采用CTAB法提取柑橘黄龙病DNA得到模板DNA 溶液；(2)柑橘黄龙病的LAMP扩增，配置反应体系为25 μ L，所述反应体系中各组分的含量为 5 X Reaction Buffer,8mM MgSO4U. 2mM dNTPs、Bst DNA 聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP、 I. 6 μ M omp_BIP、0. 2 μ M omp_F3、0. 2 μ M omp_B3、模板 DNA I. 0 μ L,加 ddH20 补足 25 μ L, 混勻，于63°C水浴锅中反应70min,之后80°C下灭活5min结束反应；所述5XReaction Buffer 含 IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20。(3)反应结束后，观察浊度，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；或在反应液中加入 SYBR Green I显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性；或琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，图谱中出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性。有益效果本发明的LAMP检测方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需电泳及特殊仪器，便于在田间大规模应用，该方法为HLB病害监测构建了一个快速检测的技术平台。说明书附I为LAMP琼脂糖凝胶电泳图，表明样品I中含有柑橘黄龙病，样品2和3分别为阴性对照和水对照。图2为本发明特异性的琼脂糖凝胶电泳图，I-柑橘黄龙病；2_柑橘黑星病(国内)；3_柑橘黑星病(巴西)；4_柑橘溃瘍病；5_柑橘炭疽病；6_柑橘褐斑病；7_阴性对照； 8-水对照。
具体实施例方式实施例I :(I)柑橘黄龙病核酸提取利用CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA，提取方法参照Murray和Thompson (1980) 方法，具体操作如下I.按2%的比例将β -巯基乙醇加入到2% CTAB抽提缓冲液(w/v)中，在65°C 水浴中预热[CTAB IOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. O), 20mmol/LEDTA (pH = 8· O)，I. 4mol/L NaCl，最后pH调为8. O]。2.称取O. 5g柑橘叶脉，置于研钵中加液氮研磨成粉末，用药勺迅速将粉末转入加入有2ml预热的CTAB抽提液的离心管中，盖严后迅速摇匀。3.于65°C水浴45min,中途每隔IOmin轻柔颠倒混勻一次。4.冷却后加入等体积饱和酚/氯仿/异戊醇(25 24 I)，轻轻颠倒混匀乳化 IOmin,离心力12000g室温离心IOmin05.取上清液至新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24 I)，轻轻颠倒混匀乳化IOmin,离心力12000g室温离心IOmin (重复一次该步骤)。6.加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴30min。7.离心力12000g 4°C离心lOmin，弃上清液，分别用70%乙醇和冷无水乙醇清洗沉淀一次，室温下风干；用100 μ I灭菌的双蒸水溶解DNA，用手指轻弹离心管使沉淀充分悬浮，-20°C保存备用。(2)柑橘黄龙病的LAMP扩增，配置反应体系为25 μ L，所述反应体系中各组分的含量为 5XReaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20] (5μ L) ,8mM MgSO4U. 2mM dNTPs,Bst DNA聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP (5; -GCCATGATAC GACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAA T-3/ )、I. 6 μ Momp-BIP(5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCC TCAGA-3' )、0. 2 μ M omp_F3 (5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3' )、0. 2 μ M omp_B3 (5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3')、模板 DNA I. 0 μ L (样品I)，加ddH20补足25 μ L，混匀，同时以阴性样品(样品2)和水(样品3) 作阴性对照及水对照，于63°C在水浴锅中反应70min，之后80°C下灭活5min结束反应。(3)反应结束后，观察浊度，样品I为白色浑浊即为阳性，样品2、3为阴性；或在反应液中加入SYBR Green I显色液I μ 1，样品I出现绿色表明为阳性，样品2、3为橙色则表明为阴性；或琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，样品I的图谱中出现特征性梯状条带为阳性 (如图I所示)，样品2、3未出现特征性梯状条带为阴性。用该LAMP方法分别对柑橘黄龙病、柑橘黑星病(国内)、柑橘黑星病(巴西)、柑橘溃疡病、柑橘炭疽病、柑橘褐斑病等柑橘病害的DNA为模板，同时以阴性样品和水作阴性对照及水对照，进行LAMP特异性检测(如图2所示)，结果表明，只有HLB样品为阳性，对照组均为阴性，说明该方法特异性强；同时对LAMP产物酶切后，能够明显鉴定出两条带，分别为70bp和133bp。另外，通过采用一系列稀释的质粒DNA，进行了 LAMP和普通PCR的灵敏度检测，结果发现LAMP的灵敏度是普通PCR的100倍。
权利要求
1.一种柑橘黄龙病的LAMP快速检测方法，其特征在于包括用于检测柑橘黄龙病的 LAMP扩增特异性引物组，分别为omp-FIP5' -GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCC AAT-3'omp-BIP5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTC AGA-3'omp-F3 5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3'omp-B3 5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3'。
2.根据权利要求I所述柑橘黄龙病的LAMP快速检测方法，其特征在于按照如下步骤完成(1)柑橘黄龙病病叶总DNA提取，采用CTAB法提取柑橘黄龙病DNA得到模板DNA溶液；(2)柑橘黄龙病的LAMP扩增，配置反应体系为25μ L，所述反应体系中各组分的含量为 5 X Reaction Buffer,8mM MgSO4U. 2mMdNTPs,Bst DNA 聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP、I. 6 μ M omp_BIP、0. 2 μ M omp-F3>0. 2 μ M omp_B3、模板 DNA I. 0 μ L,加 ddH20 补足 25 μ L,混勻，于 63°C水浴锅中反应70min,之后在80°C下灭活5min结束反应；所述5 X Reaction Buffer含 IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mMKCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20。(3)反应结束后，观察浊度，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；或在反应液中加入SYBR Green I显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性；或用琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，图谱中出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种柑橘黄龙病LAMP快速检测方法，包括用于检测柑橘黄龙病的LAMP扩增特异性引物组，分别为omp-FIP、omp-BIP、omp-F3和omp-B3。应用本发明及其建立的检测方法，解决了现有技术的检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、操作复杂、仪器设备要求高等缺陷，特别适合田间样品快速检测、HLB流行监控和脱毒苗木的鉴定，对该病的监测构建了一个快速检测的技术平台。
文档编号C12Q1/04GK102605092SQ201210101160
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者周常勇, 唐科志, 李中安, 苏华楠, 黄丽 申请人:中国农业科学院柑桔研究所