专利名称：结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病原生物学、分子微生物学和核酸化学领域，涉及一种新型的基因点突变检测探针的设计方法和序列，以及其在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用，这种方法可以直观快速并可视化的检测结核分枝杆菌利福平耐药突变。
背景技术：
由结核分枝杆菌引起的结核病(Tuberculosis,简称TB)是一种古老的疾病,在很早以前就在世界广泛传播，20世纪50年代以来，异烟肼、利福平等有效治疗结核药物的发现，大大提高了结核病治愈率，并降低了结核病的复发率，使结核病 成为一种可治愈和控制的疾病。在一些发达国家，结核病已基本得到控制。然而近些年来，由于一些国家对结核病防治工作的忽视，结核病的防治不能获得预期效果；很多地方结核病化疗方案不合理，管理不善，缺乏监控，造成结核分枝杆菌耐药菌株，特别是耐多药菌株的产生和传播，加大结核病治疗的难度，加剧结核病疫情的恶化；加上艾滋病的流行以及经济全球化造成的人口广泛流动，促使结核病卷土重来，重新成为全球紧迫的公共卫生问题。到了 20世纪90年代，结核病疫情在世界的许多地方已经失控，全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约为800 1000万，每年约有300万人死于结核病。中国结核病的疫情同样严峻，呈现患病率高、死亡率高、耐药率高、年递减率低的“三高一低”的势态。当前我国是全球22个结核病高负担国之一，结核病人总数仅少于印度，是全世界患者第二多的国家。面对这样的形势，科研工作者需要发展新的诊断技术和治疗药物，解决结核病防治中的棘手问题。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也常简称为结核杆菌或结核菌,是结核病的致病菌。结核分枝杆菌耐药主要是由于基因组中药物靶基因随机突变造成的。目前使用的一线抗结核药物主要包括利福平和异烟肼，其中利福平在细菌中的靶蛋白为RNA聚合酶的β亚基，利福平与RNA聚合酶的β亚基结合，阻碍mRNA合成，抑制转录过程，阻断细菌的蛋白质合成，达到抑菌的作用。研究表明结核分枝杆菌利福平耐药通常由其RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB突变所致，这些突变大部分(90%以上)位于一个81bp的区域，称之为 RFP 耐药决定区(Rifampicin Resistant Determination Region, RRDR)。目前耐药结核分枝杆菌检测的方法主要是培养法，但结核分枝杆菌生长缓慢，需要4 8周才能给出结果，而且阳性率不高，仅为30% 40%，导致很多结核病人得不到及时诊治。而基因突变和结核分枝杆菌耐药性之间具有相关性，因此很多研究者发展各种突变检测的方法，通过检测相关的基因突变来检测结核菌耐药。目前研究者用于检测结核分枝杆菌耐药突变的方法包括分子信标和反向探针杂交，但这两种方法操作较复杂，且需要专门的仪器。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足，提供一种针对耐药结核分枝杆菌检测的可视化检测探针，用于结核病利福平耐药突变的可视化检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针，其包括 锚定探针，其3’端含有3段GGG序列参与G-四链体形成，或其3’端含有I段GGG序列参与G-四链体形成；竞争探针，其互补区与野生型靶序列完全互补，所述野生型靶序列的核苷酸序列如 SEQIDNo. I 所示；突变检测探针，其互补区与相应的突变型靶序列完全互补，其5 ‘端具有I段GGG序列参与G-四链体形成，或其5 ‘端具有3段GGG序列参与G-四链体形成；所述锚定探针的互补区与靶序列上的与检测探针互补区段的下游互补，所述锚定探针与检测探针在结合在相应的突变型靶序列上时，两者之间能够形成G-四链体；在对靶序列PCR产物进行检测时，为防止发夹结构影响探针与靶核酸的结合，其还包括一对绝缘探针，所述绝缘探针分别结合在锚定探针结合区域的下游和突变检测探针结合区域的上游。在反应体系中加入这两个探针能与探针(锚定探针和突变检测探针)在靶核酸结合区域的旁侧区域互补，和单链靶核酸形成稳定的双链，从而打开靶核酸形成的发夹结构，有利于突变检测探针与靶核酸的结合。针对耐药结核分枝杆菌检测，本发明选用结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB为目的基因，主要集中于其利福平耐药决定区，这段区域负责编码相当于大肠杆菌RNA聚合酶β亚基507位至533位，共27个氨基酸(黄海荣，金奇，马珣，陈曦，李惠文，庄玉辉.中国耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特点.中华结核和呼吸杂志，2001，24(4)231 235)。具体地，本发明根据rpoB基因突变核心区525-529位氨基酸所包含的所有突变类型设计相应的检测探针簇和若干探针组，探针簇包含一条共有的锚定探针A，一条共有的竞争探针SIB，及根据突变类型设计的一系列突变检测探针B。探针簇包含若干探针组，分别针对检测区域内相应的突变类型。所述锚定探针具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，所述竞争探针具有SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，所述突变检测探针为SEQ ID No. 4 12所示核苷酸序列中的一个或多个。此外还可包括绝缘探针L和探针R，其核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 13 和 14 所示。为方便使用，本发明还包括含有所述上述可视化检测探针的试剂盒。上述可视化检测探针在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用。本发明还提供一种可视化检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的方法，其包括如下步骤A、PCR扩增待测样品的靶核苷酸序列；B、将上述探针与靶核苷酸互补配对，并加入Hemin，通过DNA过氧化物酶所催化的显色反应，来判断是否存在结核分枝杆菌利福平耐药突变。发明的优点和效果I、可用于可视化结核分枝杆菌利福平多位点耐药突变检测，包括9种突变类型；探针簇及其包含的探针组均可很好的区分野生型序列和突变型序列，所有的探针组对相应突变型序列和野生型序列的区分度，即探针对二者产生信号强度的比值，均大于20倍；而探针簇对突变型序列和野生型序列的区分度均大于15倍；所有结果均仅用肉眼观察即可明确地区分突变型序列和野生型序列。2、本发明设计的探针体系包括两个层次，可满足不同检测需要，探针簇可用于快速筛查结核分枝杆菌rpoB基因的利福平耐药决定区是否存在突变；而探针组则可用于检测某种特定突变，特别是那些与高度耐药相关的突变类型。3、本发明设计的探针组和探针簇能够对临床样品来源的具有复杂二级结构的PCR产物检测表现出很好的区分度，目前所得结果对突变型和野生型rpoB基因PCR产物的区分度大于7倍。
图I.结核分枝杆菌rpoB基因利福平(RFP)耐药决定区突变位点结核分枝杆菌利福平耐药决定区，rpoB基因510-533位氨基酸，其中下划线表示易突变的碱基。 图2. DNA过氧化物酶的不对称拆分-组装将DNA过氧化物酶序列d (GGGTAGGGCGGGTTGGG)，不对称地分为两个部分，一部分包含3段GGG序列，另一部分只含有一段GGG序列，这两段序列的5’端或3’端分别与靶核酸相邻区域互补序列融合，形成探针A和探针B。有靶DNA-C存在时，探针A和探针B与靶核酸的相邻区域互补，它们中DNA过氧化物酶形成序列相互靠近，折叠为G-四链体结构，与Hemin结合后，形成有活性的DNA过氧化物酶。这样可通过DNA过氧化物酶所催化的显色反应，检测溶液中靶核酸C的存在。图3.探针簇对野生型序列和相应突变型序列的选择性探针簇对野生型序列和相应突变型序列都表现出好的选择性，从照片上看，探针簇本身及野生型检测样品基本无色，而各种突变型样品则是很明显的绿色(2 10)。表格为探针簇实验方案和结果，探针簇对相应突变型序列的信号是对野生型信号的15倍以上。图4.各探针组对野生型序列和相应突变型序列的选择性各探针组对野生型序列和相应突变型序列都表现出好的选择性，从照片上各探针组对野生型序列基本无色，而相应突变序列则是明显的绿色(Ib 9b)。表格为各探针组实验方案和结果，所有的探针组对相应突变型序列的信号是对野生型信号的20倍以上。图5.探针簇对突变型菌株His526Tyr的检测探针簇对利福平耐药结核分枝杆菌ropB基因突变情况的检测，探针簇对野生型菌株PCR产物及对照基本无色，而突变型菌株PCR产物则呈现明显的绿色(d)。探针簇对突变型菌株产物信号是对野生型信号的7倍以上。检测结果耐药菌株在525-529位氨基酸区域有突变，与测序结果相符。图6.第3探针组对突变型菌株His526Tyr的检测第3探针组对利福平耐药结核分枝杆菌ropB基因突变情况的检测，探针组对野生型菌株PCR产物及对照基本无色，而突变型菌株产物则呈现明显的绿色(d)，探针组对突变型菌株产物信号是对野生型信号的10倍以上。检测结果耐药菌株为526位氨基酸突变，CAC突变为TAC，与测序结果相符。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知常规操作。实施例II. DNA过氧化物酶突变检测探针体系的设计(l)rpoB基因突变核心区序列如图I所示，本发明包含525位到529位氨基酸的9种突变类型，具体突变及相应的检测探针如下表
权利要求
1.结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针，其包括 锚定探针，其3’端含有3段GGG序列参与G-四链体形成，或其3’端含有I段GGG序列参与G-四链体形成； 竞争探针，其互补区与野生型靶序列完全互补，所述野生型靶序列的核苷酸序列如SEQID No. I 所示； 突变检测探针，其互补区与相应的突变型靶序列完全互补，其5 ‘端具有I段GGG序列参与G-四链体形成，或其5 ‘端具有3段GGG序列参与G-四链体形成； 绝缘探针，包括探针L和探针R，分别能结合在锚定探针靶向区域的下游和突变检测探针靶向区域的上游，和单链靶核酸形成稳定的双链； 所述锚定探针的互补区与靶序列上的与突变检测探针互补区段的下游互补，所述锚定探针与突变检测探针结合在相应的突变型靶序列上时，两者之间能够形成G-四链体。
2.根据权利要求I所述的可视化检测探针，其特征在于，所述锚定探针具有SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列，所述竞争探针具有SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，所述突变检测探针为SEQ ID No. 4"12所示核苷酸序列中的一个或多个,所述绝缘探针包括探针L和探针R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 13和14所示。
3.含有权利要求I或2所述可视化检测探针的试剂盒。
4.权利要求I或2所述可视化检测探针在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用。
5.一种可视化检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的方法，其包括如下步骤 A、PCR扩增待测样品的靶核苷酸序列； B、将上述A的探针与祀核苷酸互补配对,并加入Hemin,通过DNA过氧化物酶所催化的显色反应，来判断是否存在结核分枝杆菌利福平耐药突变。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用。本发明针对利福平耐药突变，根据结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变核心区所包含的突变位点设计合成检测探针簇，包括共有的锚定探针A、绝缘探针L和R、突变检测探针B和共有的竞争探针SIB，探针B与和探针SIB具有相同的靶DNA互补区，仅突变位点的碱基种类不同。具体探针簇包含9个探针组，每个探针组含一种特定的突变检测探针B，此法设计的各探针组和探针簇对合成的野生型和突变型检测片段有良好的区分性，并能准确检测利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因525-529位氨基酸具体的突变位点，具有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102628085SQ20121012184
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者冯烁, 周翔, 孙小明, 章晓联, 罗凤玲, 邓明刚 申请人:武汉大学