专利名称：一种鸡坏死性肠炎(a型)灭活疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗制备方法。属于兽用生物制品制造领域。
背景技术：
鸡坏死性肠炎又称为梭状芽孢杆菌肠炎(Clostridial enteritis),菌群失衡症(dysbacteriosis)或小肠细菌生长过度症(SIB0)。是由产气荚膜梭菌(ClostridiumperfringenS)A型或C型引起的一种疾病，A型产气荚膜梭菌产生α毒素，C型产生α和β毒素，这两种毒素是引起坏死性肠炎的主要毒素。病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征，正常鸡群的发病率为I. 3% 37. 3%，无特定病原鸡群的发病率可高达62% (王泽华，李灿恒.鸡坏死性肠炎的诊断与防治，中国禽业导刊，2002，19 (14)35-36)。目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的疫苗，治疗该病主要采用抗生素。国内A型梭菌类疫苗生产采用的是厌气肉肝汤和肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。大规模发酵用合成培养基按照产气荚膜梭菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有产毒量高、质量稳定、操作简便等优点。合成培养基是细菌疫苗质量好坏的关键因素，有鉴于此，本发明旨在设计一种适合A型产气荚膜梭菌CVCC37株生长、产毒量高、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基，制备A型产气荚膜梭菌灭活疫苗。
发明内容
将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1% 2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧培养/或静置培养6h,培养结束后经3000r/min离心30min,去除菌体,分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经O. 6%的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20%的氢氧化铝胶配制成疫苗。本发明详细描述I.疫苗生产用菌种(I)来源产气荚膜梭菌CVCC37株菌种，原C57_1，F21A，强毒株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。(2)菌种特性毒力肉肝胃酶消化汤培养物上清静脉注射，O. 05ml致死小白鼠；0. I I. Oml致
死家兔。免疫原性2. Oml浓缩铝胶苗免疫家兔可产生75% 100%保护。
2培养基采用本发明设计的合成培养基(I)配方(W/V)如下:蛋白胨L 5g,酵母粉O. 5g,氯化钠O. 25g,磷酸氢二钾O. 45g,葡萄糖O. 5g,氯化铁O. OOOlg,半胱氨酸盐酸盐O. 05g, VcO. OOlg,去离子水加至IOOml。(2)合成培养基配制方法按配方称取各成分溶于去离子水中，用2mol/L的氢氧化钠调节pH值至8. O 8. 5。116°C高压灭菌 30min。(3)合成培养基检验、
I)性状溶液澄清透明、呈棕色。2)无菌检验按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五版三部.中国农业出版社，2006，以下称《中国兽药典》)规定的方法进行，应无菌生长。3) pH 值应为 8. O 8. 5。4)生长试验⑴种子液制备将A型产气荚膜梭菌菌CVCC37株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用Iml普通肉汤(中国兽医药品监察所提供)稀释后，接种于IOml肉肝胃酶消化汤中，置37°C培养18 24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管O. 2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2 8°C保存，使用期不得超过15日。取一级种子O. Iml接种IOml肉肝胃酶消化汤，37°C培养6小时，纯粹检查合格后作为二级种子。(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。⑵菌液培养及判定将种子液按1%接种200ml液体培养基的500ml三角瓶，37°C静置培养6小时，同时设I个不接种阴性对照。分别取样3000r/min离心30min，取上清按现行《规程》进行毒力测定。毒力应达到50MLD/ml，且阴性对照应无菌生长。5)贮藏与有效期液体培养基应现配现用，高压灭菌后放置室温即刻使用。3疫苗制造(I)种子液制备将A型产气荚膜梭菌CVCC37株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用Iml肉肝胃酶消化汤(中国兽医药品监察所提供)稀释后，接种于IOml肉肝胃酶消化汤中，置37°C培养18 24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管O. 2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2 8°C保存，使用期不得超过15日。取一级种子O. Iml接种IOml肉肝胃酶消化汤，37°C培养6小时，纯粹检查合格后作为二级种子(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。(2)疫苗制造将种子液按培养基总量的1%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧培养/或静置培养6小时。培养结束后菌液3000r/min离心30min,取上清经8Ku截留分子量的超滤浓缩系统浓缩后，立即加入O. 6%的甲醛溶液灭活脱毒4 6日，灭活脱毒完全后加入终浓度20%的氢氧化铝胶和O. 006%硫柳汞制成灭活疫
苗。 (3)成品检验物理性状本品静置后，上层为黄褐色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后成均匀混悬液。无菌检验按现行《中国兽药典》附注进行，无应菌生长。安全检验皮下接种14日龄的肉鸡10只，每只2ml，观察10日，不应出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。效力检验皮下注射14日龄的肉鸡5只，每只0.5ml，14日后，连同条件相同的对照肉鸡5只，各静脉注射O. 2ml (含1MLD) A型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，免疫组至少4/5保护，空白对照组5/5死亡。甲醛、硫柳汞含量测定按现行《中国兽药典》附录进行，制品中甲醛残留含量应不超过O. 5%，硫柳汞残留含量应小于O. 01%。本发明涉及微生物的信息本发明涉及的A型产气荚梭菌菌株，菌号分别为CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，均来自中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心(中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版.中国农业科学技术出版社，2002, p41、p43、p44、p45、p44)。本发明的积极意义目前国内尚无鸡坏死性肠炎灭活疫苗，而其他A型产气荚膜梭菌类疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤或厌气肉肝汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎灭活疫苗生产提供了有力的保障。
具体实施例方式实施例IA型产气荚膜梭菌CVCC37株(原C57-1株)合成培养基的研究通过静置培养A型产气荚膜梭菌CVCC37株筛选出该合成培养基配方,对该合成培养基的配制条件和培养条件进行优化，并与肉肝胃膜消化汤的产毒性能进行比较，结果该配方37°C静置培养6小时产毒性能达到50 100MLD/ml，产毒能力达到或超过肉肝胃膜消化汤。对该合成培养基的适应性进行研究，结果该合成培养基只适用于CVCC37株的培养。I 材料I. I培养基原材料胰酪蛋白胨(批号VM732731-644)，购自MERCK公司；酵母浸粉(批号911948)购自OXOID公司；磷酸氢二钾、葡萄糖、氯化铁、半胱氨酸盐酸盐、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、VB1, Vki, Vc,甲硫氨酸均为分析纯化学试剂，购自北京化学试剂公司。I. 2肉肝胃膜消化汤肉汤(批号为0130、0227、0307、0115、0119、0205)，A型试管使用规格25ml、三角瓶使用规格500ml，中国兽医药品监察所培养基组提供。
I. 3 菌种产气荚膜梭菌CVCC37 株、CVCC52 株、CVCC2027 株、CVCC2030 株、CVCC2014 株，O. 3ml/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。I. 4 动物小鼠ICR系，30 35日龄、体重16 20g，SPF级，由中国兽医药品监察所实验动物组采购并提供。2方法与结果2. I基础配方筛选从不同组合配方中，通过培养产气荚膜梭菌CVCC37株，进行产毒效果比较，筛选基础配方。 称取氯化钠2. 5g、磷酸氢二钾4. 5g，溶于IOOOml去离子水中，用2mol/L的氢氧化钠调PH值为8. O 8. 5。将蛋白胨与酵母粉按不同比例(W/V)设计成9个配方，标记为I 9(具体比例及编号结果见表1)，用上述缓冲液分别定容至100ml，116°C灭菌30分钟，同时设立肉肝胃酶消化汤对照。按1%加入种子液，37°C静置培养6小时，取培养好的菌液3000r/min离心30min,取上清测毒。结果见下表I。表I 9组基础配方产毒性能测毒结果
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权利要求
1.一种鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗制备方法，其特征在于将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1% 2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧发酵培养/或静置培养6小时，培养结束后经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0.6%的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20%的氢氧化铝胶配制成疫苗。
2.如权利要求I所述的鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗及其生产方法，其特征是其中所使用合成培养基的配方(W/V)是蛋白胨I. 5g，酵母粉0. 5g，氯化钠0. 25g，磷酸氢二钾0. 45g,葡萄糖0. 5g,氯化铁0. OOOlg,半胱氨酸盐酸盐0. 05g, VcO. OOlg,去离子水加至IOOml。
全文摘要
本发明涉及一种用合成培养基生产鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗的方法。目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的灭活疫苗，而针对其他动物的梭菌疾病灭活疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗生产提供了有力的保障。
文档编号C12N1/20GK102698259SQ20121019287
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者孙晔, 朱良全, 李聪研, 田冬青, 蒋玉文 申请人:北京中海生物科技有限公司