专利名称：：一种抗辐射中药发酵液的制备的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药加工及生物发酵领域，特别涉及中药黄芪、三七、緑茶的发酵エ艺，及通过这种方法得到的发酵产物的抗辐射作用。
背景技术：
：黄芪总黄酮是黄芪的主要有效成分之一，多达30余种，其抗辐射作用效果明显。杨映雪等研究了黄芪总黄酮对辐射损伤小鼠的防护研究，结果表明黄芪总黄酮抗辐射效果明显，受照小鼠存活率明显提高，外周血WBC、PLT及脾脏的损伤作用显著降低[1]。胥正敏等以人正常骨髄间充质干细胞为研究对象，用6tlCoY射线进行照射，结果表明黄芪总黄酮能够对人正常骨髄间充质干细胞起到辐射防护作用[2]。皂苷广泛存在于许多中药，而三七中总皂苷含量较大，并且近年来有学者研究发现三七总皂苷具有较强的抗辐射作用。为了探讨三七总皂苷的抗辐射疗效，陈锡文等进行了实验研究，结果显示三七总皂苷能明显提高受照小鼠的红细胞、白细胞和骨髄有核细胞数，且小鼠胸腺、脾脏指数显著升高，碳粒廓清指数増加M。邹丹等发现三七总皂苷能明显提高受照小鼠的外周血WBC、Hb、BMC总数及CFU-S和CFU-GM集落产率，得出了结论三七皂苷可以起到增强骨髄造血机能，达到对辐射后小鼠骨髄抑制的对抗作用[4]。茶多酚是茶叶中最具价值的功效成分，有分布广含量高的特点，主要包括儿茶素、花色素、黄酮及黄酮醇、酚酸及缩酚酸类化合物气近年来，众多学者对茶多酚的医疗利保健功效进行了研究，发现茶多酚具有清除自由基、抗衰老等多种活性，并且证实了其具有明显的抗辐射作用[6’7]。曹明富通过实验研究了茶多酚对受6tlCoY照射小鼠的损伤防护，结果显示，茶多酚能够提高受照小鼠的免疫器官指数、血像、CFU-S及粒细胞MI，并且使骨髄PEC的细胞微核率受到抑制，说明了茶多酚对辐射损伤具有一定的防护治疗作用[8]。我国是中药的发源地，资源极其丰富，经过千年传承已拥有十分系统的理论，但是再近些年来对中药的现代化研究进展比较缓慢，导致了中药的发展受到限制，使中药至今还不能被世界完全接受。利用微生物对中药进行发酵处理是中药现代化研究史上的ー个重要创新，为中药的开发开辟了一条新途径。现代中药发酵制药技术是在继承传统中药发酵炮制法的基础上，结合现代生物工程技术方法包括发酵技术等，定向改变中药的性能，或根据中药之间的特性有目的有针对性进行组合，利用単一菌种，或用混合菌种定向发酵。通过微生物在发酵过程中产生的酶系对中药底物进行氧化、还原化、酷化、羟基化、甲基化等多种化学反应[9]。经过发酵后能够给中药带来很多有益处，首先是对中药中有效成分产生影响。微生物在代谢过程中分泌出纤维素酶、蛋白酶、木质素酶等多种酶类，降低了中药中有效成分浸出的传质阻力，使其更充分的被提取M。另外，因微生物发酵是在常温常压下进行，条件温和，避免了中药活性成分遭到破坏，并且通过ー些特殊酶的作用还可以对中药中的某些成分进行修饰、转化，降解生物大分子从而实现提高中药药效或产生新药效的目的参考文献[I]杨映雪，陈建业，费中海，等.黄芪总黄酮对辐射损伤小鼠的防护作用研究[J].重庆医科大学学报，2010，35(4):504507.[2]胥正敏，陈建业，李贤富，等.黄芪总黄酮对人正常骨髓间充质细胞的抗辐射损伤作用[J]·中药药理与临床，2011，27(3)3941.[3]陈锡文，管敏强.三七总皂甙对小鼠抗辐射损伤的实验研究[J].中华放射医学与防护杂志，2005，25(6):559560.[4]邹丹，乔海灵，全宏勋，等.三七皂甙对辐射所致小鼠骨髄抑制的对抗作用[J].中华放射医学与防护杂志，2000，20(6):413415.[5]杨贤强，王岳飞，陈留记，等.茶多酚化学[M].上海上海科学技术出版社，2003，I7，12，109125.[6]KatiyarSK,ElmetsCA.Greenteapolyphenolicantioxidantsandskinphotoprotection[J].IntJOncol,2001,18(6):13071313.[7]吴亮宇，林金科.茶多酚抗辐射研究进展[J]·茶叶，2011，37(4):213217.[8]曹明富.茶多酚对小鼠辐射损伤的防护效应[J].茶叶科学，1998，18⑵139144.[9]钦传光，李世杰，丁焰，等.发酵工程在医药研究和生产中的应用[J].湖北エ学院学报，2000，15(I):6770.[10]葛喜珍.发酵在中药研究中的应用[J]·时珍国医国药，2008，19(2):386387.[11]阮晓东，张惠文，蔡颖慧，等.微生物在中药生物转化中的应用[J].中草药，2009,40(1):149-152.
发明内容本发明依据现代科技研究成果，选用黄芪、三七、緑茶作为实验原料，其主要功效成分依次为黄酮、皂苷和茶多酚。以上述三种有效成分能够在发酵液中充分浸出为目的，筛选食药真菌对中药生物转化的最佳组合并对其发酵培养基和发酵条件进行优化。运用正交试验的方法对发酵产物组方，测定较优组方抗辐射作用的生理生化指标。具体技术内容如下I以中药黄芪为发酵底物，利用食药真菌灵芝对其进行发酵，并考察不同时间发酵液中总黄酮含量的变化情况，确定食药真菌灵芝发酵黄芪到第8天时，发酵液中总黄酮含量最高，为2.305mg/go并且通过单因素和正交试验，以发酵液中总黄酮含量为指标，对食药真菌灵芝发酵黄芪的培养基及发酵条件进行优化，得出最佳培养基为可溶性淀粉2g/100mL，硝酸钾0.4g/100mL，磷酸ニ氢钾0.lg/100mL，硫酸镁0.lg/100mL，最佳发酵条件为接种量10%，黄芪添加量8g/100mL，温度33°C，初始pH值5.5。最后采用优化后エ艺进行验证得出发酵液中总黄酮含量为2.411mg/g。2以中药三七为发酵底物，利用食药真菌猪苓对其进行发酵，并考察不同时间发酵液中总皂苷含量的变化情况，确定了食药真菌猪苓发酵三七到第8天时，发酵液中总皂苷含量最高，为69.063mg/go并且通过单因素和正交试验，以发酵液中总皂苷含量为指标，对食药真菌猪苓发酵三七的培养基及发酵条件进行优化，得出最佳培养基为可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸ニ氢钾O.3g/100mL，硫酸镁O.lg/100mL，最佳发酵条件为接种量10%，三七添加量5g/100mL，温度25°C，初始pH值7。最后采用优化后エ艺进行验证得出发酵液中总皂苷含量为72.329mg/g。3以中药绿茶为发酵底物，利用食药真菌香菇对其进行发酵，并考察不同时间发酵液中茶多酚含量的变化情況，确定了食药真菌香菇发酵三七到第6天吋，发酵液中茶多酚含量最高，为166.889mg/g。并且通过单因素和正交试验，以发酵液中茶多酚含量为指标，对食药真菌香菇发酵緑茶的培养基及发酵条件进行优化，得出最佳培养基为葡萄糖4g/100mL，酵母膏O.2g/100mL，磷酸ニ氢钾O.3g/100mL，硫酸镁O.lg/100mL，最佳发酵条件为接种量8%，中药添加量8g/100mL，温度25°C，初始pH值7。最后采用优化后エ艺进行验证得出发酵液中茶多酚含量为170.749mg/g。4以照射后第3、10天的外周血中白细胞数作为评价指标，采用正交设计法对黄芪、三七、緑茶的发酵物进行剂量配比组方，优选出最佳组方为组方7，即三七发酵液O.4g/kg·(!,黄苗发酵液3.8g/kg·(!,绿茶发酵液2.25g/kg*d;组方2,即三七发酵液O.8g/kg*d,黄芪发酵液2.5g/kg·d，绿茶发酵液2.25g/kg·d。5对受辐射小鼠外周血白细胞(WBC)数，免疫器官指数，内源性脾集落形成単位(CFU-S)，骨髓有核细胞(BMC)数，骨髓嗜多染红细胞微核率(PCE)五项指标測定，结果显示，组方2和组方7均具有一定抗辐射作用。目前中药抗辐射作用研究日渐增多，但是效果显著得到开发的较少。本发明采用微生物发酵的方法，目的在于提高药效，获得ー剂具有良好抗辐射作用效果的组方，为以中药为原材料的抗辐射产品研究开辟了一条新思路，同时在黄芪、三七及緑茶的进ー步应用研究上提供了理论基础。具体实施例方式实施例一黄芪发酵液的制备以中药黄芪为发酵底物，利用食药真菌灵芝对其进行发酵，采用发酵培养基为可溶性淀粉2g/100mL，硝酸钾O.4g/100mL,磷酸ニ氢钾O.Ig/1OOmL,硫酸镁O.Ig/1OOmL,最佳发酵条件为接种量10%，黄芪添加量8g/100mL，温度33°C，初始pH值5.5，培养时间为8-10d，得黄芪发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。实施例ニ三七发酵液的制备以中药黄芪为发酵底物，利用食药真菌猪苓对其进行发酵，采用发酵培养基为可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸ニ氢钾O.3g/100mL，硫酸镁O.lg/100mL，最佳发酵条件为接种量10%，三七添加量5g/100mL，温度25°C，初始pH值7，培养时间为8_10d，得三七发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。实施例三緑茶发酵液的制备以中药绿茶为发酵底物，利用食药真菌香菇对其进行发酵，采用发酵培养基为葡萄糖4g/100mL，酵母膏0.2g/100mL,磷酸ニ氢钾0.3g/100mL,硫酸镁0.Ig/1OOmL,最佳发酵条件为接种量8%，中药添加量8g/100mL，温度25°C，初始pH值7，培养时间为6_8d，得绿茶发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。实施例四正交设计法优选中药发酵物的抗辐射组方实验动物健康的雌性昆明小鼠，18_22g，清洁级。辐照条件采用synergy医用直线加速器对小鼠进行一次性全身照射，照射剂量3Gy,剂量率O.5Gy/min,照射时间6min,革巴心距离100cm。正交设计分组用L9(33)三因素三水平正交表进行试验分组，因素水平表见表1，其中因素A为黄芪发酵液，因素B为三七发酵液，因素C为绿茶发酵液，以每千克小鼠每天灌服发酵液中所含原始生药材量表示各因素的水平剂量。另设ー组辐照模型对照组，各试验组分别于照射前连续灌服20天，每天一次，模型对照组以等量蒸馏水代替，对各组均以同一辐照条件进行一次性全身照射，照射后仍继续灌服。表I试验分组因素水平表i'able丄l'hetableofthegroupingfactorofexperiment权利要求1.一种黄芪发酵液，其特征是以中药黄芪为发酵底物，利用食约真菌灵芝对其进行发酵，采用发酵培养基为可溶性淀粉2g/100mL，硝酸钾O.4g/100mL，磷酸二氢钾O.lg/100mL,硫酸镁O.lg/100mL,最佳发酵条件为接种量10%，黄芪添加量8g/100mL，温度33°C，初始pH值5.5，培养时间为.8-10d，得黄芪发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。2.一种三七发酵液，其特征是以中药黄芪为发酵底物，利用食药真菌猪苓对其进行发酵，采用发酵培养基为可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸二氢钾O.3g/100mL,硫酸镁O.Ig/1OOmL,最佳发酵条件为接种量10%，三七添加量5g/100mL，温度25°C，初始pH值7，培养时间为8-.10d，得三七发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及约品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。3.—种绿茶发酵液，其特征是以中药绿茶为发酵底物，利用食药真菌香菇对其进行发酵，采用发酵培养基为葡萄糖4g/100mL，酵母膏O.2g/100mL，磷酸二氢钾O.3g/100mL，硫酸镁O.lg/100mL,最佳发酵条件为接种量8%，中药添加量8g/100mL，温度25°C，初始pH值7，培养时间为6-8d，得绿茶发酵液，经3500r/min离心15min，该上清液即可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。4.一种中药发酵液，其特征是将权利要求I至3所述方法制备的三种中药发酵液进行剂量配比组方，该组方具有一定抗辐射作用，可以在制备抗辐射药品、食品及保健品中应用。5.根据权利要求4所述的中药发酵液，其特征在于该发酵液可以单独或与其它药物配伍或加入药学上可以接受的辅料，制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂，经口服、皮肤、粘膜、直肠方式应用。6.本发明是采用摇瓶的方法进行的，如进行放大生产，可根据本发明的基本原理采用各种生物反应器、发酵罐等方式进行发酵处理，另外除本发明中所用食药真菌灵芝、猪苓、香菇外，也可是其它大型食药真菌如平菇、黑木耳、金针菇等，这是本领域的研究人员所能理解的。全文摘要本发明提供一种抗辐射中药发酵液的制备方法，涉及中药加工及生物发酵领域，尤其是中药黄芪、三七、绿茶的发酵方法。本发明以食药真菌作为发酵的出发菌种，分别对三种中药进行发酵，并将此法所得三种发酵液进行剂量配比组合。动物实验显示本发明中中药发酵液具有明显抗辐射作用。本发明的特点是中药发酵液即可直接作为食(饮)品、保健品及药品使用，或者用于制备食(饮)品、保健品及药品的原料，在预防和治疗辐射损伤方面具有良好的开发应用前景。文档编号A23L1/29GK102688280SQ20121019294公开日2012年9月26日申请日期2012年6月13日优先权日2012年6月13日发明者姜云,孙旸,王莘,董浩,陈述申请人:吉林农业大学