专利名称：检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。
背景技术：
凝血是血液由液体状态转变为不流动的凝胶状态的过程，是生物体天然的自我保护机制，能阻止血液从破损的血管中流失。除血小板外，所有参与凝血过程的物质统称为凝血因子，目前已知的凝血因子有20余种，包括传统的因子I-XIII，以及PK、HMWK等。当血 管内皮细胞受到创伤，组织因子等蛋白与血液接触，凝血会立即启动。首先血小板流向创伤点堆积形成栓塞，称为初级止血反应；同时，血浆中的各种凝血因子发生级联反应形成纤维蛋白，在血小板栓塞上形成紧密的纤维蛋白网，该过程称为次级止血反应。血液凝固是一系列凝血因子连锁反应的结果，其特点是当凝血过程被激活时，其中一个凝血因子以其上游凝血因子为底物，使之激活为具有活性的酶，而该酶又催化激活下一个因子。凝血异常将增加失血或血栓形成的风险。牛凝血因子XI缺失(Factor XI deficiency)最早(1969年)发现于美国荷斯坦牛中(Kociba等，1969)，此后，1975年在加拿大也发现一头患病的荷斯坦公牛(Gentry等，1975)。该遗传缺陷病的临床表现为血凝时间延长，血浆中XI因子活性降低。杂合个体除因注射、去角、阉割等损伤而发生出血症外(严重的需要输血)，出血可能性相对较小，而隐性纯合子出血情况较为严重，其新生犊牛大多死亡。其分子致病机理是牛27号染色体上的凝血因子XI (Factor XI)基因第12外显子上一个76bp的插入造成(Marron等，2004)。2005年日本科学家报道了日本黑牛中一种新的凝血因子XI突变。在Factor XI基因的第9外显子上有15bp的插入，造成凝血活性降低(Kunieda等，2005)。同时，报道了一种检测该变异的方法。其基本原理是，在该突变两侧设计引物，通过聚合酶链式反应扩增目的片段，进而通过琼脂糖凝胶电泳方法进行基因型判定。然而，在实际应用中，由于琼脂糖凝胶分辨率低，而该目的片段的野生型与突变型的条带只相差15bp，因此不易区分，导致出现假阴性的结果。此外，该检测方法所需高浓度琼脂糖凝胶的制作过程也较为繁琐，且电泳时间长。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测方法中易出现假阴性结果的缺陷，提供一种能够准确高效地检测牛凝血因子XI基因外显子9内15个核苷酸插入突变的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为引物对I:a)上游引物 wild-F5’ -CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’ ；
b )下游引物 wi Id-R5 ’ -GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3 ’ ；和引物对2:a')上游引物 mutant-F5，-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3，；b')下游引物 mutant-R5，-AATGGCATATATTCTGCACA-3，。引物对I的上游引物跨越了插入片段区域，但不包含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。引物对2的下游引物包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基因序列特异 结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因没有扩增产物。本发明还提供含有上述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供上述PCR引物组合或试剂盒在检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用，包括步骤1)提取待测牛的基因组DNA ；2)以步骤I)中提取的DNA为模板，分别采用弓丨物对I和引物对2，进行PCR扩增反应；3 )分析PCR产物。其中，步骤3)具体为扩增反应结束后，将分别用引物对I和引物对2扩增的产物混合，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断待测牛的基因型若扩增结果仅出现一条206bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为不含15bp插入突变的野生型纯合子；若扩增结果仅出现一条112bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的突变纯合子；若扩增结果出现206bp和112bp两条DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的杂合子。
上述PCR反应体系以20 μ I计为
20μΜ 模板 DNAΙμΙ
2.5mM dNTPsΙ. μΙ
ΙΟμΜ上游引物2μ1
ΙΟμΜ下游引物2μ1
5υ/μ Taq DNA聚合酶0.2μ
10 X PCR反应缓冲液2μ1
25mM Mg2+1.2μ\
ddH20补足至 20μ! PCR 反应条件为94 °C 7min ；94 °C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 30s,共 35 个循环；72 °C 7min。用引物对I和引物对2扩增的PCR产物长度相差94bp，利用低浓度(2%)的琼脂糖凝胶，经过较短时间(约30min)电泳即能灵敏区分不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提闻了检测的准确性。本发明提供的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒，操作简便，特异性好，灵敏度高，通过对基因型的判定，从而准确筛查出遗传缺陷携带者。
图I为本发明野生型等位基因及突变型等位基因的测序图。图2为本发明的引物在牛凝血因子XI基因序列上的位置。图3为本发明实施例3中利用引物组合PCR检测凝血因子XI基因型的结果；其中，1-6分别为6个待检样本，NC为阴性对照，PC为阳性对照，M为DNA分子量标准。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程,或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例I用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合的合成根据15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置(图I )，人工合成以下引物引物对I:a)上游引物 wild_F5’ -CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’ ；b )下游引物 wi I d-R5，-GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3，；和引物对2:a')上游引物 mutant-F5，-TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3，；b')下游引物 mutant-R5，-AATGGCATATATTCTGCACA-3，。上述引物组合对应于牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置如图2所示。引物对I的上游引物(wild-F)跨越了插入片段区域，但不包含插入片段，因此仅能与野生型等位基因序列特异结合，特异性地扩增野生型等位基因；而突变型等位基因没有扩增产物。引物对2的下游引物(mutant-R)包含插入片段的序列，因此仅能与突变型等位基因序列特异结合，特异性地扩增突变型等位基因；而野生型等位基因没有扩增产物。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。实施例2检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒包括实施例I中的引物组合，即引物对I和引物对2。此外，还可包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。为了便于检测结果分析，还可进一步包括已知基因型的阳性对照。实施例3利用PCR引物组合检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变遗传缺陷的特异性分析I. I样本来源
本实施例中采用的牛源随机选取辽宁雪龙牧场的普通牛(Bos taurus)六头，分别编号广6。1.2DNA 提取I. 2. I牛血液DNA提取采用天根生化生物技术公司DP318试剂盒从血块中提取基因组DNA，具体步骤如下I)取出样品，融化后，剪取200yL于2mL离心管中；2)加入600 μ L细胞裂解液CL，摇匀；
3) IOOOOrpm离心lmin，弃去暗红色上清；4)重复2和3步一次；5)加入200 μ L缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；6)加入20 μ L蛋白酶K，220 μ L缓冲液GB，充分晃动摇匀；7) 56°C烘箱中消化3小时以上，消化早期，要颠倒混匀数次，直至溶液变澄清，无血块颗粒；8)加入200 μ L无水乙醇,轻轻晃动混勻,转移到吸附柱中，12000rpm离心30s,弃
去收集管中的暗绿色废液；9)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液GD，12000rpm离心30s,弃去收集管中废液；10)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW，12000rpm离心30s,弃去废液；11)加入500 μ L漂洗液Pff, 12000rpm离心30s,弃去废液；12) 12000rpm 离心 2min ；13)将吸附柱转移到新的I. 5mL离心管中，开口凉干；14)加入100 μ L在64°C预热的洗脱缓冲液TB，静置2min ；15) 12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液中，4°C保存备用或-20°C长期保存。I. 2. 2公牛冻精DNA的提取I)将细管冻精转移到2mL离心管中，加入500 μ L生理盐水，涡旋离心，弃废液保留沉淀，重复以上操作一次；2)向沉淀中加入400 μ L冻精裂解液(含DTT)、100 μ L20%的SDS，涡旋，最后加入IOyL的蛋白酶K，充分混匀，56°C消化4h或过夜；3)消化结束，加入300 μ L饱和食盐水，颠倒混匀，低温离心，去除蛋白质杂质，将上清液转管保留，并加入1000 μ L冰乙醇，轻轻颠倒混匀至絮状沉淀不再增加，再离心，此时弃去上清液，所得的沉淀即DNA，用500 μ L75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发，最后加适量TE缓冲液溶解，_20°C保存。I. 3样品DNA的梯度稀释检测上述提取的牛基因组的DNA浓度，进行梯度稀释，稀释后最低浓度为20 μ Μ，于-20°C保存备用。I. 4PCR 反应分别采用引物对I和引物对2，进行PCR扩增反应。反应体系(20μ I):
20μΜ 模板 DNAΙμΙ
2.5rnM dNTPsΙ. μΙ
ΙΟμΜ上游引物2μ1
ΙΟμΜ下游引物2μ1
5lj/plTaqDNA 聚合酶0·2μ1
10 X PCR反应缓冲液2μ1
25mM Mg2+1.2μ!
ddH20补足至 20μΙ,使用Applied Biosystems9700 型 PCR 仪，PCR 反应程序94°C预变性 7min ；94°C变性30s，57。。复性30s，72。。延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸7min。两对引物的PCR反应体系和扩增条件完全相同。I. 5 结果各取扩增产物2 μ L混合后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(TAE缓冲液)，电压为110V，30分钟后在凝胶成像系统中观察电泳结果。如图3所示，根据分子量标准(Marker)判定每个样品的基因型，其中，泳道广6分别对应于编号1飞的牛。泳道I和2内仅观察到112bp条带，由此判定为突变纯合子；泳道3和4内观察到112bp条带和206bp条带，由此判定为杂合子；泳道5和6内仅观察到206bp条带，由此判定为野生型纯合子。本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置，巧妙设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建立了 PCR检测体系。其中，第I对引物(wild-F和wild-R)仅能特异扩增出野生型的等位基因；第2对引物(mutant-F和mutant-R)仅能特异扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度(2%)的琼脂糖凝胶，经过较短时间(约30min)电泳即能灵敏区分不同的基因型。避免了已有方法的缺点，提高了检测的准确性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的PCR引物组合，其为 引物对I : a)上游引物wild-F 5’ -CTGCTGTGCAGTGTTCTGCC-3’ ； b)下游引物wild-R 5’ -GGAGCGTCTATGGGACTTGA-3’ ；和 引物对2 : a')上游引物 mutant-F 5 ’ -TGCAAGCCCTTTCTTCTGAT-3，； b')下游引物 mutant-R 5 ’ -AATGGCATATATTCTGCACA-3，。
2.含有权利要求I所述引物组合的检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求I所述引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤 1)提取待测牛的基因组DNA; 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，分别采用引物对I和引物对2，进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)具体为 扩增反应结束后，将分别用引物对I和引物对2扩增的产物混合，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断待测牛的基因型若扩增结果仅出现一条206bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为不含15bp插入突变的野生型纯合子；若扩增结果仅出现一条112bp的DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的突变纯合子；若扩增结果出现206bp和112bp两条DNA条带，则判定待测牛的基因型为含15bp插入突变的杂合子。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以20μ I计为 20μΜ 模板 DNAΙμΙ 2.5mM dNTPs1.6μ1ΙΟμΜ上游引物2μ1ΙΟμΜ下游引物2μ15υ/μ1 Taq DNA聚合酶0.2μΙ10 X PCR反应缓冲液2μΙ 25mM Mg2+1.2μ! ddH20补足至 20μ1。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为94°C7min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，共 35 个循环；72°C 7min。
全文摘要
本发明提供一种检测牛凝血因子XI基因第9外显子内15bp插入突变的试剂盒，该试剂盒中包括Seq ID No.1-4所示的引物组合。本发明基于15bp插入片段在牛凝血因子XI基因第9外显子中的位置，设计了跨越15bp插入片段区域的2对引物，并在此基础上建立了PCR检测体系。其中，第1对引物(Seq ID No.1和2)仅能特异扩增出野生型的等位基因；第2对引物(Seq ID No.3和4)仅能特异扩增出突变型等位基因；2个PCR产物长度相差94bp，利用低浓度的琼脂糖凝胶，经过较短时间电泳即能灵敏区分不同的基因型，从而准确筛查出遗传缺陷携带者。
文档编号C12Q1/68GK102776288SQ20121026672
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者俞英, 吴蒙, 孙东晓, 张毅, 张沅, 张胜利, 徐仙洲, 李强, 王雅春 申请人:中国农业大学