专利名称：A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用基因重组技术构建高效(效价高、抗原匹配性和免疫保护率高等特征)的A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用以及用该疫苗株生产A型口蹄疫疫苗的方法，属于生物技术和生物制品领域。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由 FMD 病毒(Foot-andnouth diseasevirus, FMDV)引起的猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV是一种单股正链RNA病毒，属小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。该病毒分为 7 个血清型(A、0、C、Asial、SATl、SAT2、和 SAT3 型)，其中 A 型 口蹄疫病毒流行较为广泛，是仅次于0型口蹄疫的世界主要流行毒株。近年来，口蹄疫疫情频繁发生且呈全球化流行的态势，这不仅对世界畜产品经济构成了巨大的威胁，而且引发了人们对食品安全等社会公共卫生问题的担忧，造成发生疫情的国家及地区的畜产品贸易损失惨重。A型口蹄疫多在我国周边国家发生和流行，我国于1958年在新疆阿克陶地区首次发现A型口蹄疫。1963年初从蒙古国传入我国内蒙古地区并引发较大规模的流行，疫情波及我国7省200多个县市，而在此后的近40年间，无A型口蹄疫疫情流行，然而，2009年年初我国武汉、上海地区相继爆发了 A型口蹄疫疫情，并很快传播到多个省份。此次A型口蹄疫的爆发使得我国原本复杂的防疫形势更加严峻。口蹄疫抗原变异毒株产生的原因是抗原表位氨基酸序列变异产生抗原多样性的结果，抗原表位是诱变宿主免疫应答的重要物质基础，疫苗株与流行毒株的抗原表位匹配的好坏决定着疫苗免疫保护率的高低。A型口蹄疫流行病毒的复制能力及病毒稳定性较低，全基因组序列分析表明，其3’ UTR核苷酸和细胞受体结合部位的VPl的氨基酸有变异，在此位置有氨基酸发生变异可能意味着毒株复制能力和毒株抗原性的改变。进化树分析表明，爆发的A型口蹄疫来自东南亚国家，与国内曾经出现过的A型流行毒无遗传衍化关系。疫苗接种是防控口蹄疫的主要手段之一，从流行毒中筛选新的疫苗种毒是最常见、快速的的一种方法，但不是每个流行毒都能驯化成为理想的疫苗种毒，往往是免疫原性(抗原谱匹配，免疫动物后诱导动物机体产生足够的免疫力)或生产性能(收毒时间、产毒量和病毒稳定性)不符合要求。理想的疫苗种毒来之不易，创新疫苗种毒筛选技术，建立疫苗种毒更新的长效机制十分急迫。口蹄疫反向遗传操作技术的成熟为我们提供了解决疫苗种毒筛选的新方法，利用其可对病毒基因进行改造和修饰，人工筛选获得预期生物学特性的毒株，并与流行毒迅速匹配，获得优良疫苗毒株并制备成疫苗用来防控流行毒株。
发明内容
本发明的目的在于解决当前缺乏抗原匹配、生产性能不佳的A型口蹄疫疫苗株的技术问题，而提供的一种A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用，用该疫苗株灭活制备疫苗，免疫牛28天后，用10000倍BID5tl毒剂量进行攻毒实验，连续观察12天，结果表明全剂量100%保护。50%保护剂量(PD5tl)在10. 81 13. 59，该疫苗可用于我国及其周边国家A型口蹄疫病毒的预防和控制。本发明的另一个目的在于提供一种上述A型口蹄疫重组病毒疫苗株的反向遗传技术构建方法。本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
一种A型口蹄疫重组疫苗株，其特征在于该疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO: I所示。一种所述的制备A型口蹄疫重组疫苗株的反向遗传系统(质粒)，其特征在于该系统包含(I)真核转录质粒，该真核转录质粒能够表达A型口蹄疫重组病毒全长基因cDNA 序列，质粒在病毒全长cDNA两侧嵌有核酶(hammerhead ribozyme (HamRz)和hepatitisdelta ribozyme (HdvRz)),在其外侧的 5’ 端添加有聚合酶(polymerase, pol) I 和 pol II转录启动子，在3’端有终止子；(2) A型口蹄疫重组质粒prA-FMDV感染敏感细胞，具体为BHK-21细胞或IBRS-2细胞，所述A型口蹄疫重组病毒是用上述反向遗传系统拯救获得的，该真核转录质粒在适应细胞、乳鼠和猪体内均能够拯救出相应病毒。一种所述的A型口蹄疫重组病毒的感染性克隆构建方法，其特征在于是以0型口蹄疫病毒的拯救系统为骨架，通过J/7II和没41限制性内切酶，用A/WH/CHA/09毒株含有部分L和Pl基因的序列SEQ ID NO: I替换相应基因，得到prA-FMDV的重组质粒。所用A/WH/CHA/09毒株是2009年I月分离于湖北武汉，经BHK-21传代培养10代，保藏于农业部兽医局指定保存单位国家口蹄疫参考实验室。使用RNAeasy Mini Kit提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA，用引物oli皮Vo( I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物APl-F和APl-R扩增获得A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl的基因片段，上述三条针对A/WH/CHA/09株的特异性引物分别是
OIig/Vot I: 5 ~ttttctaRaygggrcffct叫_3，
APl-F :5’-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3'
APl-R :5’-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgt c_3’，
在以上的特异性引物中，扩增A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因序列所用上游引物APl-F中含J/7II限制性酶切位点；下游引物APl-R中含下划线部分的限制性酶切位点，用上述特异性引物进行扩增，得到A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因片段，大小为2400bp，构建 50iiL 反应体系，扩增条件为94°C 5min,94°C 30s, 57°C 30s, 68°C 2min30s, goto 2，35个循环，721 8min, PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA ；
pr0/CHA/99是本实验室前期构建的含有0/CHA/99毒株全长cDNA的质粒，其中，0/CHA/99毒株是0型口蹄疫毒株，1999年分离于中国香港，现保存于国家口蹄疫参考实验室，pr0/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5’端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子；在病毒基因组3’端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；及嵌合在0型口蹄疫病毒0/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和戊型肝炎酶的核心序列，其中戊型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5’末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3’末端C处，将含O型口蹄疫病毒0/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA，将O型口蹄疫病毒0/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl片段，分别用J/7II和双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白Pl的重组质粒，将重组质粒命名为prA-FMDV,且仅位点I与流行毒株有差异。一种所述的A型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于使用所述重组质粒prA-FMDV，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重组病毒。一种所述的A型口蹄疫重组病毒制备成的疫苗，其特征在于免疫猪和牛后有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，对A型AISA谱系毒株的10000倍 牛半数感染剂量(BID5tl)攻毒实验，免疫保护率能达100%，50%保护剂量(PD5tl)为10. 81 13. 59。一种所述的A型口蹄疫重组病毒在制备预防A型口蹄疫病毒导致的疾病的疫苗中的应用，该疫苗可用于我国及其周边国家A型口蹄疫病毒的预防和控制。本发明具有如下积极效果
我国口蹄疫A型武汉毒的流行，对灭活苗种毒的筛选与更换提出了新的研究课题。该病毒细胞病变时间不稳定、滴度低，达不到生产要求。目前国际通行的疫苗种毒筛选原则是一是抗原谱对号，可对当前流行毒株有效保护；二是免疫原性强，可诱导动物产生足够强的免疫应答反应；三是生产性能好，疫苗候选毒株具有病变时间短、滴度高和病变稳定等较好的生产性能，可用于工业化生产。从流行毒种筛选新的疫苗株是最常见和最能快速见效的一种方法，直接解决了抗原谱对号的问题。但对另外两个问题，免疫原性和生产性能问题，仍然需要试验来证明。而现实情况是，并不是每一个流行毒株都能驯化成理想的疫苗种毒，往往是免疫原性或生产性能不符合要求。通过大量的试验表明，理想的疫苗种毒得之不易，创新疫苗种毒筛选(构建)技术，建立疫苗种毒更新的长效机制十分急迫。口蹄疫反向遗传技术的成熟为我们提供了解决疫苗种毒的筛选的新方法。通过反向遗传技术实现对病毒基因的改造和修饰，能够人工获得预期生物学特性的毒株，并可以与流行毒株配型，以期与变异迅速的流行毒株进行匹配。可以尽量减少流行毒株驯化环节带来负面影响。为以后快速制备高效疫苗奠定坚实的基础，对整体提高FMD疫苗质量具有重要意义。本发明就是借助已经建立的高效反向遗传系统，通过相关基因的改造，来建立病变时间短、病毒滴度高的毒株，解决筛选疫苗种毒的生产和驯化问题，以此疫苗毒株框架为构建高效疫苗种毒奠定基础。依据口蹄疫分子流行病学，利用反向遗传学进行FMD疫苗株多种表型改善和提闻。I)、在病毒整体水平上提高了 FMD疫苗株的生产性能(如病毒滴度和病变时间)，本发明制备的毒株能够提高滴度100倍以上，降低了抗原制备成本。将流行毒株A/WH/CHA/09部分L和Pl基因进行替换并拯救出重组病毒rA-FMDV，测定病毒生物学特征，结果表明，该重组病毒rA-FMDV具有病变时间短、滴度高的特点，重组病毒rA_FMDV在第5代，病变时间降为11 h，从第5代至第9代完全病变时间稳定在10 h左右。而流行毒A/WH/CHA/09在第6代至12代，完全病变时间在25 20 h左右，在13代后，病变时间才缩短在10 h左右。rA-FMDV的病毒滴度(TCID5tl)在第5代达6. 8，从第5代至第9代病毒滴度稳定在7. 5以上，而流行毒在第5代滴度为2. 8，从第5代至第9代病毒滴度稳在2. 8至4. 5之间。由此可见重组病毒显著提高了其生产性能。2)、实现提高疫苗毒株抗原匹配性和免疫应答性，本发明构建的疫苗毒株的结构蛋白与流行毒株一致，抗原完全匹配，提高了疫苗株与流行毒株的针对性；
3)、本发明制备的疫苗株含有潜在的疫苗标识位点，为后期开发标记疫苗奠定基础；
4)、与流行毒株制备的疫苗相比，本发明制备的疫苗株提高了疫苗免疫应答和保护性高，PD5tl值在10.81 13. 59，增强了疫苗田间防控效果；
6)、并且根据周边国家疫情，借助本发明技术，可以建立有针对性的疫苗战略储备库，·实现无需流行毒株(不动活毒)的疫苗毒株构建方式；
7)、本发明技术改变了疫苗毒株筛选驯化技术受病毒自然属性制约大、费时费力、成功率低的缺陷，可以实现更为主动有效的疫苗毒株构建，实现了口蹄疫灭活疫苗毒种制备工艺的革新，具有重大应用价值，提升疫苗毒种技术工艺，属于国际领先水平。
图I为本发明的实例I中口蹄疫病毒A/WH/CHA/09株部分L和Pl基因片段的电泳图。图2为本发明的实例2中口蹄疫病毒拯救系统prO/CHA/99。图3为本发明的实例2中A型口蹄疫病毒重组质粒prA-FMDV的构建策略。图4为本发明的实例2重组毒株与流行毒株位点I差异比较图。图5为本发明的实例3中拯救重组病毒rA-FMDV感染BHK-21细胞后引起的CPE。图6为本发明的实例4. I中接种了拯救重组病毒rA-FMDV的BHK-21细胞间接免疫荧光图。图7为本发明的实例5. 2中拯救重组病毒rA-FMDV与流行毒株A/WH/CHA/09在BHK-21细胞上的致病力试验比较图。
具体实施例方式本发明结合国家口蹄疫参考实验室近年来的毒株积累和对其全基因组序列的分析研究，将我国A型口蹄疫毒株A/WH/CHA/09的部分前导蛋白L和结构蛋白Pl基因，通过限制性内切酶位点与由建立的0型口蹄疫病毒0/CHA/99株的拯救系统中相应核苷酸序列进行替换，得到一种A型口蹄疫病毒重组质粒prA-FMDV ;所述特异性核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。一种制备A型口蹄疫重组疫苗株的反向遗传操作系统，该系统包含(I)真核转录质粒，该转录质粒能够表达所述重组A型口蹄疫病毒全长基因cDNA序列，质粒在病毒全长 cDNA 两侧嵌有核酶(hammerhead ribozyme (HamRz)和 hepatitis delta ribozyme(HdvRz)),在其外侧的5’端添加有聚合酶(polymerase,pol)1和pol II转录启动子,在3’端有终止子；(2)A型口蹄疫重组质粒prA-FMDV感染敏感细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞。所述A型口蹄疫重组病毒是用上述拯救系统拯救获得的，该质粒可以在适应细胞、乳鼠和猪体内拯救出相应病毒。A型口蹄疫重组病毒的感染性克隆，是以0型口蹄疫病毒疫苗株的拯救系统为骨架，通过J/7II和限制性内切酶，用A/WH/CHA/09毒株含有部分L和Pl基因替换相应基因，得到prA-FMDV的重组质粒。一种A型口蹄疫重组病毒的制备方法，使用所述重组质粒，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重组病毒，该方法制备的A型口蹄疫重组病毒，命名为rA-FMDV。上述A型口蹄疫病毒重组质粒prA-FMDV的构建方法，是采用特异性引物对A型口蹄疫毒株A/WH/CHA/09的基因组进行扩增，得到部分前导蛋白L和结构蛋白Pl基因。利用特异的J/7II和酶切位点对0型口蹄疫病毒的质粒prO/CHA/99进行基因替换，构建 得到A型口蹄疫病毒重组质粒命名为prA-FMDV。转染BHK-21细胞第2代48h出现致细胞病变(CPE)，连续传代后经RT-PCR、间接免疫荧光、反向间接血凝和乳鼠致病力实验等均检测到了拯救的FMDV。经生物学特性测定后，与流行毒相比重组病毒rA-FMDV具有病变时间短，病毒滴度高的特点。上述A型口蹄疫重组病毒疫苗株的应用中，将由A型口蹄疫重组病毒感染性克隆得到的基因工程病毒，灭活制成疫苗，测定该疫苗的I3D5tl在10. 81 13. 59之间。解决实际生产中的难题，获得了改良的A型口蹄疫高效疫苗毒株。通过攻毒后的带毒状况检测，发病牛能够检测到带毒，而免疫保护牛没有形成带毒现象。综合上述指标，该重组毒株是一个高效疫苗株。下面结合具体实施实例对本发明做进一步地描述，但具体实施并不对本发明做任何限定。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京科学出版社，2004)中所述的方法进行。实施例I. A型口蹄疫病毒A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因序列的获得。本发明人所用A/WH/CHA/09毒株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。使用RNAeasy Mini Kit (Qiagen公司)提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA，用引物oli皮Vo( I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物APl-F和APl-R扩增获得A/WH/CHA/09毒株的基因序列。上述三条针对 A/WH/CHA/09 株的特异性引物分别是 oligAbt 1(5' -ttttctaRaygggrcffct叫-3，)、APl-F (5’-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3')和 APl-R (5’-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgt c_3’)。在以上的特异性引物中，扩增A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因序列所用上游引物APl-F中含J/7II限制性酶切位点；下游引物APl-R中含SgrAl限制性酶切位点(下划线部分)。用上述特异性引物进行扩增，得到A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因片段，大小为2400bp(图1)，与预期大小相符。扩增所用适合长片段扩增、性能优良的Premix LA Taq Version 2. 0 (TaKaRa公司)DNA聚合酶,按照产品说明书构建 50ii L 反应体系，扩增条件为94°C 5min,94°C 30s, 57°C 30s, 68°C 2min30s, go to 2，35个循环，72°C 8min，PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA ;扩增产物的电泳结果如图I所示。实施例2. A型口蹄疫重组病毒感染性克隆的构建。
在已建立的0型口蹄疫病毒0/CHA/99株拯救系统prO/CHA/99的框架基础上，0型口蹄疫毒株拯救系统prO/CHA/99如图2所示在病毒基因组5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶 II 启动子(Human cytomegalovirus RNA polymerase II promoter, P11)及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子(MouseRNA polymerase I promoter, P1);在病毒基因组3'端下游含鼠源聚合酶终止子I(Murineterminator I, T1)和聚合酶终止子 II (Murine terminator II, T11)序列；及嵌合在 0 型口蹄疫病毒0/CHA/99全长cDNA基因组两端的柳头银酶(Hammerhead ribozyme, HamRz)和戍型肝炎酶(Hepatitis delta ribozyme, HdvRz)的核心序列，其中戍型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5'末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3'末端C处。将含0型口蹄疫病毒0/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病 毒RNA前体，再经HamRz和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA。将0型口蹄疫病毒0/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与实例I得到的部分L和Pl片段分别用J/7II和双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白Pl的重组质粒，将重组质粒命名为prA-FMDV (图3),且仅位点I与流行毒株有差异(图4)。实施例3. A型口蹄疫重组病毒拯救。用QIAGEN公司生产的QIAGENfiPlasmid Plus Maxi Kit纯化制备由实例2得到的含A型口蹄疫重组病毒全基因组cDNA的重组质粒prA-FMDV。待BHK-21单层生长至80% 90%时用于转染。用0PTI-MEMI培养基清洗细胞,在脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)的介导下将4 ii g的重组质粒转染BHK-21细胞，将其在含有5% C02的37°C培养箱中培养，同时设立脂质体对照和正常细胞对照。转染后4 6 h吸去细胞上清，加入MEM培养基(Invitrogen公司)，继续培养，观察细胞病变的出现情况；待细胞出现90%左右病变时收获病毒。反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生CPE，出现细胞变圆，成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片(如图5所示)。将A型口蹄疫重组病毒命名为rA-FMDV。在图4中，A :为拯救重组病毒感染BHK-21细胞出现的CPE的图片；B :为正常对照BHK-21细胞图片。 实施例4.拯救A型口蹄疫重组病毒的鉴定。4. I间接免疫荧光检测病毒抗原。将转染后盲传至第2代的BHK-21细胞，_70°C反复冻融三次后，按一定比例接种至底部放置了载玻片的生长有BHK-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60% 70%)，置于含5%C02的37°C培养箱中，24 h后按常规方法做间接免疫荧光，一抗为A型FMDV兔阳性血清，二抗为标记FITC羊抗兔IgG (Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种第2代细胞液的BHK-21细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生(如图6所示，A 为接种了拯救重组病毒rA-FMDV的BHK-21细胞；B :为未接种病毒的正常BHK-21细胞)，表明重组病毒感染的BHK-21细胞中有FMDV蛋白的表达。
4. 2反向间接血凝鉴定试验
收集Iml在BHK-21细胞上传代出现CPE的时间趋于稳定的第I代拯救病毒，58 V 40min灭活，将灭活后的病毒按1:2做连续稀释(同时设空白对照和流行毒A/WH/CHA/09的阳性对照)，每个稀释度取50 ML加入96孔板中，再加入25 ML FMDV抗体致敏化的绵羊红细胞，置微量混合器上振荡I 2 min，加盖，室温放置2 h后观察结果。当贴附于血细胞上的FMDV抗体与游离的抗原相遇时，形成抗原抗体凝集网络，绵羊红细胞也随之凝集，出现肉眼可见的血细胞凝集现象，从而根据细胞沉积情况判定结果。结果显示，按1:32稀释的rA-FMDV感染BHK-21细胞时发生红细胞凝集，而未出现红细胞沉积；1:32稀释的流行毒75%出现红细胞凝集，阴性对照样品出现红细胞完全沉积；反向间接血凝试验结果表明引起BHK-21细胞病变的是FMDV。实施例5.拯救A型口蹄疫重组病毒的致病力试验。
5. I对乳鼠致病力试验。将在BHK-21细胞分别传至第6代的拯救病毒和流行毒分别用PBS缓冲液10倍倍比稀释，各取10_5 10_9倍比稀释的病毒液经皮下接种2 4日龄乳鼠，每个稀释度各接种4只，接种剂量为200 u L/只，连续观察8 d。空白对照组4只乳鼠接种PBS缓冲液200U L/只，观察并记录乳鼠的死亡情况，用Karber法计算LD5(I。接种拯救病毒和流行毒的乳鼠在接种20 h后，部分表现出呼吸困难、后肢麻痹和用镊子夹尾声音撕哑等症状。48 h后接种流行毒和拯救重组病毒的乳鼠陆续死亡，对照组乳鼠正常。最后根据统计结果，计算出拯救病毒 rA-FMDV 的 LD5tl 为 l(T7_5/0. 2mL，流行毒株 A/WH/CHA/09 的 LD5Q1(T5 ° /0. 2mL。5. 2在BHK-21细胞上的致病力试验。按照常规方法对BHK-21细胞进行消化，加入含10%胎牛血清的MEM细胞培养基，分装于28个2mL细胞培养瓶中，于37°C含有5% C02的培养箱中培养，待细胞单层长到90%时备用。用MEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10_3_° 10_8_°)的病毒液分别加入2mL细胞培养瓶，每个稀释度4瓶，按10%接毒后37°C感作lh，用不含血清的MEM清洗细胞2 3次，加入不含血清的MEM，放入37 °C含有5% C02的培养箱中进行培养，观察3天，用Read-Muench氏法测定对BHK-21细胞的半数感染量(TCID5tlX按照该法测定拯救病毒rA-FMDV和亲本毒1_9代的滴度，并统计各代病变时间。拯救病毒rA-FMDV接种BHK-21细胞后，细胞传代至第5代，病变时间降为llh，从第5代至第9代完全病变时间稳定在10 h左右；而亲本毒在第6代至12代，完全病变时间在25-20h左右，在13代后，病变时间才缩短在10 h左右。用该毒进行TCID5tl试验，空白对照组BHK-21细胞培养24 h长满96孔细胞培养板，符合实验要求。实验组培养到4 h，各稀释度的细胞大部分出现病变，培养到9 14 h细胞全部脱落。用Read-Muench氏法进行计算，改造的基因工程毒在第5代，滴度达6. 8，从第5代至第9代病毒滴度稳定在7. 5以上。亲本毒在第5代滴度为2. 8，从第5代至第9代病毒滴度稳在2. 8至4. 5之间(如图8所示)。实施例6.拯救A型口蹄疫重组病毒疫苗的制备及安检。将BHK-21用含10%胎牛血清的DMEM培养传代。按常规转瓶单层BHK-21传代细胞培养法制备rA-FMDV拯救病毒液，收获的病毒液即为病毒培养物，置于-40°C保存。将病毒培养物灭活用 3 mmol/1 二乙烯亚胺(Binary ethylenimine, BEI) (Sigma 公司)26°C灭活，24h后再加入一次BEI，再灭活24h。灭活后安检，用抗原浓缩纯化，将抗原收获物与ISA206佐剂(法国SEPPIC)# I :1比例混合制备疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。安检牛舌部皮下注射灭活病毒2ml/头，连续逐日观察6日，观察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均无异常。上述实验用牛为购自非疫区，并经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA (LPB-ELISA)检测0型和AsiaI型抗体均< I :4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。实施例7.疫苗免疫动物效果比对。7. I疫苗免疫攻毒保护试验
将上述实施例6中所得到的安检合格的A型口蹄疫重组病毒疫苗免疫16头牛，同时设2头非免疫牛对照(要求被免疫的牛的口蹄疫抗敌滴度不小于1:6，感染抗体为阴性)，测定其免疫效力。攻毒方法及结果判定方法均按照《Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals》(2009年版,世界动物卫生组织(OIE))中所述。免疫牛28天后，用10000倍ID5tl毒剂量进行攻毒实验，连续观察12天，结果表明用该A型口蹄疫重组病毒作为疫苗株，在培养的BHK-21细胞上增殖后灭活，与ISA206佐剂(法国SEPPIC)乳化制成疫苗，免疫牛，能有效保护中国当前A型口蹄疫流行毒的攻击。结果如表I。表I A型口蹄疫重组病毒疫苗免疫牛攻毒后临床症状和保护情况。
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iat 无mmmmmm7. 2交叉免疫中和实验。将上述实施例6中所得到的安检合格的A型口蹄疫重组病毒疫苗免疫动物所得到的血清与rA-FMDV，A/WH/CHA/09和0/CHA/99三株毒进行病毒交叉免疫中和实验，测定抗体匹配值r，其中I Sr >0.3表明毒株与疫苗有高度匹配性，疫苗免疫动物后能抵抗此毒株的攻击，可作为潜在疫苗株；r ( 0. 3表明毒株与疫苗匹配性较差，疫苗免疫动物后不能抵抗相应毒株的攻击。结果如表2。表2 .病毒交叉免疫中和试验rA-FMDV, A/WH/CHA/09和0/CHA/99的抗体匹配
权利要求
1.一种A型口蹄疫重组疫苗株，其特征在于该疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQ IDNO: I所示。
2.一种如权利要求I所述的制备A型口蹄疫重组疫苗株的反向遗传系统，其特征在于该反向遗传系统包含(I)真核转录质粒，该真核转录质粒能够表达A型口蹄疫重组病毒全长基因cDNA序列,质粒在病毒全长cDNA两侧嵌有核酶(hammerhead ribozyme (HamRz)和hepatitis delta ribozyme (HdvRz)),在其外侧的 5’ 端添加有聚合酶(polymerase, pol)I和pol II转录启动子，在3’端有终止子；(2)A型口蹄疫重组质粒prA-FMDV感染敏感细胞，具体为BHK-21细胞或IBRS-2细胞,所述A型口蹄疫重组病毒是用上述反向遗传系统拯救获得的，该真核转录质粒在适应细胞、乳鼠和猪体内均能够拯救出相应病毒。
3.—种如权利要求2所述的A型口蹄疫重组病毒的感染性克隆构建方法，其特征在于是以O型口蹄疫病毒的拯救系统为骨架，通过J/7II和没·^〗限制性内切酶，用A/WH/CHA/09毒株含有部分L和Pl基因的序列SEQ ID NO: I替换相应基因，得到prA-FMDV的重 组质粒。
4.根据权利要求3所述的A型口蹄疫重组病毒的感染性克隆构建方法，其特征在于所用A/WH/CHA/09毒株是2009年I月分离于湖北武汉，经BHK-21传代培养10代，保藏于农业部兽医局指定保存单位国家口蹄疫参考实验室，使用RNAeasy Mini Kit提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA，用引物oli皮Voi I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物APl-F和APl-R扩增获得A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl的基因片段，上述三条针对A/WH/CHA/09株的特异性引物分别是 ο I i g/Vo t I: 5 ~tttt c t aRaygggrcffc t 叫_3，APl-F 5' -ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3'APl-R:5’-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgt c_3’ ， 在以上的特异性引物中，扩增A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因序列所用上游引物APl-F中含J/7II限制性酶切位点；下游引物APl-R中含下划线部分的限制性酶切位点，用上述特异性引物进行扩增，得到A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl基因片段，大小为2400匕？，构建5(^1^反应体系，扩增条件为941 5min,94°C 30s, 57°C 30s, 68°C 2min30s, goto 2，35个循环，721 8min, PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA ； pr0/CHA/99是本实验室前期构建的含有0/CHA/99毒株全长cDNA的质粒，其中，0/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株，1999年分离于中国香港，现保存于国家口蹄疫参考实验室，pr0/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5’端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子；在病毒基因组3’端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；及嵌合在O型口蹄疫病毒0/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和戊型肝炎酶的核心序列，其中戊型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5’末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3’末端C处，将含O型口蹄疫病毒0/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA，将O型口蹄疫病毒0/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的A/WH/CHA/09毒株部分L和Pl片段，分别用J/7II和5^_ ^1双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白Pl的重组质粒，将重组质粒命名为prA-FMDV,且仅位点I与流行毒株有差异。
5.一种根据权利要求4所述的A型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于使用所述重组质粒prA-FMDV，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重组病毒。
6.一种根据权利要求5所述的A型口蹄疫重组病毒制备成的疫苗，其特征在于免疫猪和牛后有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，对A型AISA谱系毒株的10000倍牛半数感染剂量(BID5tl)攻毒实验，免疫保护率能达100%，50%保护剂量(PD5tl)为 10. 81 13. 59。
7.—种如权利要求5所述的A型口蹄疫重组病毒在制备预防A型口蹄疫病毒导致的疾病的疫苗中的应用，该疫苗用于我国及其周边国家A型口蹄疫病毒的预防和控制。
全文摘要
本发明涉及一种用基因重组技术构建效价高、抗原匹配性和免疫保护率高的A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用，该疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，所述拯救系统为人工构建的能够表达精确口蹄疫病毒基因组RNA的高效真核质粒，借此能够构建和制备口蹄疫重组病毒，使用上述质粒可以制备出高滴度和抗原匹配性好的疫苗株，制备成灭活苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，对A型AISA谱系毒株的10000倍牛半数感染剂量(BID50)攻毒实验，免疫保护率达100%，50%保护剂量(PD50)为10.81～13.59，该疫苗可用于我国及其周边国家A型口蹄疫病毒的预防和控制。
文档编号C12N15/85GK102757942SQ20121026625
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者刘湘涛, 曹伟军, 杨帆, 郑海学, 郭建宏, 靳野 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所