专利名称：结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种科研用方法，特别涉及一种用于研究光合作用的方法。
背景技术：
植物的生长发育离不开光合作用，光合作用是生物界所有物质代谢和能量代谢的物质基础，它包括一系列光物理、光化学和生物化学转变的复杂过程。对光合作用的研究有助于人们更为深入地了解光合作用的过程，进而有目的地对植株，特别是农作物进行转基因处理，以提高光合作用的效率。目前，研究参与光合作用的基因功能，主要通过稳定转化获得过表达、干涉植株，或是通过突变体，周期长，工作量大。这种研究方法效率低，很难高效地筛选出与光合作用 有关的基因。原生质体是植物细胞除去细胞壁后，由细胞质膜包裹着的那部分具有生物活性的物质。随着多种原生质体分离酶，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶等的发现，在实验室条件下大量制备高活性的原生质体已发展成为一种常规技术。已经分离得到许多植物材料的原生质体。Yoo等报道了一种利用纤维素酶R-IO以及离析酶R-IO分离原生质体的方法(Yoo, S. D. , Cho, Y. H. , and Sheen, J. (2007). Arabidopsis mesophyllprotoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2，1565-1572.)。现阶段，通过优化酶解拟南芥材料的酶液体系，摸索酶解时间，改良原生质体制备过程中的关键步骤，比如离心，过滤等可以方便而又快速地获得大量具有很强光合活性的原生质体(Riazunnisa, K. , Padmavathi, L. , Scheibe, R. , andRaghavendra, A.S. (2007). Preparation of Arabidopsis mesophyll protoplasts withhigh rates of photosynthesis. Physiol Plantarum 129, 679-686)。原生质体瞬时表达技术是以原生质体为转化受体，通过一定的方法将外源基因导入原生质体内，使外源基因得以快速表达，并且能在短期内维持表达水平的技术。原生质体瞬时表达技术与传统的稳定转化技术相比，主要的不同之处在于稳定转化将外源基因转化进入植物体内，并整合到植物基因组中，因此基因信息可遗传；而在原生质体瞬时表达系统中，则是将外源基因构建到载体质粒上，转化后在原生质体中瞬时表达，不整合到植物基因组中，也不产生可遗传后代。现阶段，尽管传统的稳定转化已经不存在技术问题，但是稳定转化周期长，需要繁琐的工作来鉴定转基因植物，工作量大，外源基因表达不稳定且效率低，因而满足不了目的基因的高通量功能分析的需求。此外，部分基因的突变体植株或者过表达植株会突变致死，这使得这类基因的研究工作受到限制。以原生质体为转化受体的基因瞬时表达技术的产生，有利于缓解这种需求，已成为目前分子生物学研究中的重要技术手段(Sheen，2001)。有关原生质体瞬时表达技术的最早报道是1969年，Aoki和Takebe利用烟草叶肉细胞原生质体和烟草花叶病毒第一次成功地将外源核酸引入原生质体(Aoki and Takebe,1969)。此后，出现了多种DNA瞬时转化方法，比如，聚乙二醇(PEG)转化法、电激转化法、基因枪转化法等，使得DNA瞬时转化效率得到很大的提高，在此基础上，可以制备多种植物材料的原生质体，转化目的基因，研究基因定位、基因功能和信号通路(Yoo et al.，2007;Zhang et al.，2011)。而随着一些新的、经济敏感的报告基因如β-葡萄糖醛酸酶(⑶S)、荧光素酶(LUC)以及绿色荧光蛋白(GFP)被引入原生质体瞬时表达系统，可以根据报告基因活性来反映外源基因的表达水平，原生质体瞬时表达系统也因此得到更为广泛的使用(Sheen, 2001)。拟南芥叶肉细胞原生质体广泛应用于基因瞬时表达研究(Yoo et al.，2007)，信号通路研究(Sheen, 2001),离子通道研究(Lemtiri-Chlieh and Berkowitz, 2004; Qiet al. , 2004)以及分子生物学等方面的研究(An et al. , 2003; Baek et al. , 2004;Lemtiri-Chlieh and Berkowitz, 2004; Kim et al. , 2006)。调制叶绿素荧光成像系统具有测量快速、简单、可靠、针对活体且测量过程对样品 生长基本无影响等特点，被广泛应用于藻类及其他高等植物的生理、生态学研究。如，用于筛选叶绿素荧光参数发生变化的突变体，进行遗传育种。Niyogi等根据NPQ参数的差异，做了莱茵衣藻光合突变体的筛选工作；他们也用同样的方法，以拟南芥为材料作了筛选工作，共鉴定出13个NPQ发生变化的突变体，筛选到了藻类和拟南芥的叶黄素循环突变体(Niyogi et al. , 1997; Niyogi et al. , 1998)。此外，也可利用调制叶绿素突光成像系统筛选虽然影响植物代谢及生长但不直接参与光合作用的突变体(Barbagallo et al.，2003)。因为调制叶绿素荧光成像系统能通过成像的方式直观地反映叶绿素荧光参数的差异及变化，不仅可以检测叶片光合作用的横向异质性，还可检测早期肉眼不可见的胁迫损伤，甚至是阐明损伤机理和调节机制。有报道调制叶绿素荧光成像系统能应用于冻害影响的直观定量(Ehlert and Hincha, 2008)，并能够定量评估拟南芥干旱处理后的存活时间(Woo et al.，2008)。又由于调制叶绿素荧光成像系统成像面积较大，可同时测量多个微藻样品，因此在生态毒理学领域也具有较大的应用(Escher et al.，2006)。可直观的检测植物光合作用相关的生理指标，研究生理过程(Muller et al. , 2001; Gould et al.,2010)。尽管如此，至今没有通过测定拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统的叶绿素荧光来研究光合作用的相关方法报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的光合作用研究方法。本发明所采取的技术方案是
一种研究光合作用相关功能基因的方法，包括如下步骤
1)制备含有叶绿体的原生质体，并将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体并确认待测基因可瞬时表达和/或反义核酸序列已使基因表达瞬时沉默；
2)将转入有待测基因和/或反义核酸序列的原生质体和对照原生质体进行暗适应处理；
3)将暗适应处理的原生质体进行光照处理，获取其荧光图像和/或荧光参数，或基于荧光图像和/或荧光参数绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线和/或光诱导曲线；4) 对比不同处理组的荧光图像、荧光参数、叶绿素荧光诱导动力学曲线、光诱导曲线中的至少一种，判断待测基因和/或反义核酸序列对光合作用的影响，确定其是否为光合作用相关基因。转入原生质体的待测基因和/或反义核酸序列至少为一种。优选的，暗适应处理的时间为8 12 min。优选的，测定叶绿素荧光诱导动力学曲 线和快速光响应曲线的程序为
1)打开不足以使原生质体进行光合作用的微弱测量光，测得最小荧光Ftl；
2)随后施加一个饱和脉冲，关闭所有的电子门，暂时抑制植物的光合作用，得到最大荧光Fm;
3)打开光化光，使原生质体光合作用，施加饱和脉冲后，得到的叶绿素荧光为光化光下最大突光Fm’ ；
4)待饱和脉冲处理后，叶绿素荧光值达到稳态之后，关闭光化光，同时打开远红光，使电子门回到开放态，F回到最小荧光Ftl附近，此时得到的荧光为Ftl'优选的，原生质体为拟南芥叶肉细胞原生质体。本发明的有益效果是
本发明方法利用原生质体瞬时表达技术结合荧光分析技术，可以快速测定待测基因对光合作用的影响，有助于人们更为快速、方便地对光合作用相关基因进行研究。本发明方法可以同时对多个基因进行研究，可以进行高通量筛选。
图I是拟南芥叶肉细胞原生质体FDA染色后的显微 图2是四周龄野生型和/7识5突变体的叶绿素荧光参数比较 图3是DCMU对叶盘和原生质体的光合电子传递抑制效果 图4是拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时表达的GFP的荧光显微 图5是瞬时过表达NPQ-GFP对原生质体的影响 图6是瞬时过表达ATPC1-GFP对原生质体Fv/Fm和ΦΡ5ΙΙ的影响 图7是瞬时过表达ATPCl-c-myc对原生质体Fv/Fm和ΦΡ5ΙΙ的影响 图8是DTT处理对原生质体与叶片的ΦΡ3ΙΙ和NPQ的影响 图 9 是瞬时过表达 TRX ml-GFP、TRX m2_GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP 对原生质体的ΦΡΞΙΙ和NPQ的影响 图10是瞬时过表达TRX fl-GFP，TRX f2_GFP对原生质体的OPSII和NPQ的影响图； 图11是瞬时过表达TRX fl-GFP与OPSII之间的关系 图12是瞬时过表达Fdl-GFP，Fd2-GFP，FTRc-GFP对原生质体叶绿素荧光参数的影响
图 13 是 Fdl-GFP，Fd2-GFP, FTRc-GFP, TRX fl-GFP 和 TRX f2_GFP 的亚细胞定位图。
具体实施例方式下面结合试验，进一步说明本发明。一、原生质体叶绿素荧光测定体系的建立实验材料及溶液
拟南芥原生质体制备溶液的配制方法 (I)母液
①MES(O. 2 M，pH 5. 7):称取3. 9 g MES溶解于100 mL去离子水；
②甘露醇(O.8 M):称取29. I g甘露醇溶解于200 mL去离子水；
③CaCl2(I M):称取100 g CaCl2 溶解于100 mL去离子水；
④KCl(2 M):称取14. 9 g KCl溶解于100 mL去离子水；
⑤MgCl2(2 M):称取20. 33 g MgCl2溶解于100 mL去离子水；
⑥BSA(10 %):称取I g BSA溶解于10 mL去离子水，分装。以上母液均用O. 45 Mffl滤膜过滤除菌，常温保存。酶液
配比为2 mL MES (O. 2 M pH 5.7),10 mL Mannitol (O. 8 Μ), 200 μ KCl (2 Μ), O. 3g Cellulase R-10,0. 08 g Macerozyme R-10,7.4 mL ddH20, 55 °C加热 10 min,冷却到室温，再加入200 μ CaCl2 (I Μ), 200 μ BSA (10%)。混合均匀，用0.45 Mm滤膜过滤得到；W5溶液
配比为2 mL MES (O. 2 M pH 5. 7)，I. 8 g NaCl, 3. 675 g CaCl2 · 2Η20，0· 5 mL KCl (2Μ), 172. 5 mL ddH20。植物材料
本试验使用的植物材料有野生型拟南芥thaliana, ecotype Columbia) 拟南芥的培养
(I)培养条件温度为23 °C，光强110 Mmol ·πΓ2 · ^，16 h光照，8 h黑暗，相对湿度60% 70%。(2)培养方法取适量拟南芥种子置于4 °C冰箱内春化4 5 d后，取出种子，将其点种在灭过菌的营养土上。盖上透明罩培养以缓苗，3 d后揭开罩子。待苗生长三至四周时，方可使用。拟南芥叶肉细胞原生质体的制备
1)选取3 4周龄、充分伸展的拟南芥叶片(叶位2、3、4对)
2)用刀片将叶片切成O.5^1 mm的细条，放入并浸没在酶液中；
3)将酶液于10mm汞柱的真空下抽真空30 min,室温黑暗静置酶解3 h ；
4)晃动酶液释放原生质体,加入等体积的W5溶液，轻轻晃动平皿，充分释放原生质
体；
5)用55Mm的尼龙网过滤原生质体,收集至15 mL圆底塑料试管中,800 rpm离心]Λ2min，沉淀的原生质体用预冷的W5溶液清洗一次，之后冰上静置30 min。拟南芥叶肉细胞原生质体制备效果的检测
使用突光素二乙酸酯(fluorescein diacetate, FDA)染色法检测原生质体活力，结果如图I所示。显微镜下可观察到制出的原生质体形状为正常的圆球状，用FDA染色5 min后，蓝光照射，呈黄绿色有活性的原生质体数目接近100%。原生质体叶绿素荧光参数测定
采用德国Walz公司的IMAGING-PAM-M-Series叶绿素荧光仪测定原生质体的叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线。测定叶绿素荧光诱导动力学曲线时，先将原生质体样品加入96孔板，暗适应10min。打开配套软件，选定感兴趣的区域(Α0Ι)，所有荧光参数的值都通过软件记录下来。用弱光(O. 5 Mmol · m_2 · s_0照射测定初始荧光(Ftl)，调制频率为I Hz，随后进行饱和脉冲光(2 700 Mmol · m_2 · s-1)处理，一个脉冲后，得到最大荧光(Fm)，打开适合拟南芥原生质体的光化光(35 Mmol · m_2 · S-1)，之后再进行饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到光化光下的最大突光(Fm’ )。充分暗适应后，PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学能量转化的有效量子产量[Y(II), OPSII]、非光化学淬灭系数(NPQ)等各参数数值均是在选定模式下系统自动计算生成。成像图直接导出观察，各参数值导出后，通过相关软件进一步分析。拟南芥叶肉细胞原生质体叶绿素荧光测量板的选取
将新鲜分离的高活力野生型拟南芥叶肉细胞原生质体分装于普通的透明96孔板中， 测定其叶绿素荧光参数。结果表明透明板中各孔原生质体间的荧光信号会相互影响，通过尝试不同的培养板，最后发现白色不透明96孔板能有效地避免这种影响，因此，后续实验均使用白色不透明板。拟南芥叶肉细胞原生质体悬浮基质的选取
拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统中常使用两种悬浮基质W5溶液和WI溶液。为了选择合适的悬浮基质，制备原生质体，分别用W5溶液和WI溶液悬浮，置于白色不透明96孔板中，测定叶绿素荧光参数Fv/Fm。实验发现相比于W5溶液，用WI溶液悬浮的原生质体，其Fv/Fm(PSII最大量子产量)较高，分别为0. 72和O. 68，选定WI为悬浮基质。不同体积、浓度拟南芥叶肉细胞原生质体Fv/Fm的比较
制备拟南芥叶肉细胞原生质体，用WI溶液悬浮，设置三个体积梯度(50 μ , οο μ 、200μι)、三个浓度梯度(4Χ105、2Χ105、1Χ105)，将原生质体分别置于白色不透明96孔板中，测定叶绿素荧光参数Fv/Fm实验发现浓度为4 X IO5个/mL，体积为200 μ 时原生质体的Fv/Fm最高。考虑到经济因素，选定的体积、浓度体系为2X IO5个/mL，体积为100 μ 。二、拟南芥叶肉细胞原生质体与叶片叶绿素荧光参数的比较
文献报道(PGR5是环式电子传递所涉及到的蛋白质)突变体的NPQ低于野生型(DalCorso et al.，2008)，除草剂二氧苯基二甲基脲(DCMU)能够阻断PSII电子从Qa向二级质子醌受体(Qb)传递，导致Qa迅速还原，光化学淬灭受到抑制，初始荧光(Fci)增加(Allahverdiyeva et al. , 2007)。因此,用DCMU分别处理野生型拟南芥的叶盘和原生质体，比较DCMU处理后二者叶绿素荧光参数发生改变的趋势，可以确定原生质体系统与植株的叶绿素荧光参数是否相似或者变化趋势一致，进而确定叶绿素荧光成像技术能否用于测定拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的叶绿素荧光参数。植物材料
采用的植物材料为拟南芥纯合突变体/7识5，及其对应的野生型拟南芥。拟南芥的处理及原生质体的制备同上。拟南芥叶片叶绿素荧光参数测定采用德国Walz公司的Imaging-PAM-M-Series叶绿素突光仪测定拟南芥叶片的叶绿素荧光诱导动力学曲线。拟南芥叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线测定的方法与原生质体叶绿素荧光诱导动力学曲线测定的方法类似，不同之处在于适合拟南芥叶片的光化光光强为110Mmol · πΓ2 · S-1 ；
四周龄野生型、突变体植株的NPQ诱导曲线的测定方法为610 Mmol · πΓ2 · s_1强度高光照射6 min,随后暗适应4 min ；
四周龄野生型、突变体原生质体的NPQ诱导曲线的测定方法为110 Mmol ·πΓ2 *s_1强度高光照射6 min,随后暗适应4 min。二氧苯基二甲基脲(DCMU)，处理拟南芥叶肉细胞原生质体
配制6个梯度为0、0. 5、1、5、10、50 μΜ的DCMU溶液，将其分别加入96孔板中，每孔10 μ 。随后，在各孔中加入原生质体90 μ ,混合均匀，使原生质体溶液中DCMU的终浓度分别为:0、0· 05、0· I>0. 5、1、5 M-M0DCMU处理拟南芥叶盘
用2 mM MES溶液配制6个梯度为0、0. 5、1、5、10、50 μΜ的DCMU溶液。用直径为6 mm的打孔器从四周龄的拟南芥叶片上打下叶盘，迅速放入配置好的DCMU溶液中，暗处理20min。处理完后，用去离子水洗去叶盘表面残留的DCMU，在Imaging-PAM的测量板上铺好叶盘，暗适应10 min,测定叶绿素突光。实验结果
为了明确原生质体的叶绿素荧光参数发生改变的趋势是否与叶片一致，选取/7识5及其对应的野生型作为比较。先测定野生型、突变体叶片的叶绿素荧光参数随后，以它们为材料分别制备原生质，测定野生型、突变体原生质体的叶绿素荧光参数Fv/Fm与NPQ。实验结果如图2所示，图中，A.四周龄野生型、/7识5突变体植株各自的Fv/Fm、1/4NPQ荧光成像图，1/4 NPQ的图像为110 Mmol · m_2 · s—1强度光强照射3 min ；B.四周龄野生型、/7识5突变体植株的NPQ诱导曲线，610 Mmol · m_2 · s—1强度高光照射6 min,随后暗适应4 min, η = 8 ；C.四周龄野生型、/7识5突变体原生质体各自的Fv/Fm、1/4 NPQ荧光成像图，1/4 NPQ的图像为35 Mmol · m_2 · s—1强度光强照射3 min后所获得；D.四周龄野生型、突变体原生质体的NPQ诱导曲线，110 Mmol · m_2 · s—1强度高光照射6 min,随后暗适应 4 min, η = 6。从图中可以看出，对叶片而言，PGR5突变后，相比野生型其非光化学淬灭常数NPQ会降低而Fv/Fm却不会发生显著改变(图2A和B)。与叶片结果相似，突变体原生质体的NPQ值相比野生型原生质体显著降低(图2 C和D)。DCMU处理野生型拟南芥叶盘和原生质体后叶绿素荧光参数的比较
分别制备野生型拟南芥的叶盘和对应的原生质体，用浓度梯度为0、0. 5、1、5、10和50μΜ的DCMU处理生型拟南芥的叶盘，用浓度梯度为0、0. 05,0. 1,0. 5、1和5 μΜ的DCMU处理生型拟南芥制备的原生质体。实验结果如图3所示，图中A. DCMU处理后，原生质体(白色柱)和叶盘(灰色柱)的叶绿素荧光参数Fv/Fm的荧光成像图及其对应的值；B. DCMU处理后，原生质体(白色柱)和叶盘(灰色柱)的叶绿素荧光参数Ftl的荧光成像图及其对应的值；C. DCMU处理后，原生质体(白色柱)和叶盘(灰色柱)的叶绿素荧光参数1/4 NPQ的荧光成像图及其对应的NPQ值；D. DCMU处理后，原生质体(白色柱)和叶盘(灰色柱)的叶绿素荧光参数OPSII的荧光成像图及其对应的值。其中，η =8。如图所示，处理原生质体所用的DCMU浓度为0、0.05、0. I、O. 5、1和5 μΜ，而处理叶盘所用的DCMU浓度则为0、0. 5、1、5、10和50 μΜ。实验结果表明随着DCMU浓度的增加，叶盘与原生质体的初始荧光(Ftl)均逐渐增大(图38)，而卩>111，咿0，？511的实时荧光OPSII均会逐渐降低(图3A，C，D)。通过实验可知，原生质体的叶绿素荧光参数能在一定程度上反映叶片的真实情况，可以通过测定原生质体的叶绿素荧光参数来分析叶片的光合作用。三、拟南芥原生质体中瞬时表达光合作用相关基因对其叶绿素荧光参数的影响 拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达技术中，原生质体需要经历PEG介导的质粒DNA转
化过程及过夜培养过程。为了明确转化后原生质体是否依然适合于叶绿素荧光测定。分 别在原生质体中瞬时转化了 GFP和NPQl-GFP融合蛋白以及GFP与ATPC1-GFP，c-myc与ATPCl-c-myc 融合蛋白。其中，NPQ1( Non-photochemical quenching 1)，编码紫黄质去环氧化酶，作为叶黄素循环中的关键酶，在强光下能够将紫黄质转变为玉米黄质，从而耗散掉过剩的光能，起光保护的作用(Niyogi et al.，1998)。缺失NPQl的拟南芥突变体，其NPQ会大大下降(Niyogi et al. , 1998),而在烟草中过表达NPQl会导致NPQ增加(Havaux etal.，2000)。ATPCl是质体ATP合酶的一个亚基，缺失ATPCl的拟南芥突变体，暗适应后，其最小荧光F。会增加，而且，其匕疋和OPSII会显著降低(Bosco et al.，2004; Wu etal. , 2007)。植物材料
本实验所用植物材料为野生型拟南芥thaliana, ecotype Columbia,Nossen)，将拟南芥种子在37 1培养箱中烘干后，置于4 °C冰箱内冷冻保存。拟南芥转化主要溶液的配制方法
(1)WI溶液(20 mL)
O. 4 mL MES (O. 2 M pH 5.7),12.5 mL Mannitol (O. 8 Μ),O. 2 mL KCl (2 Μ)6. 9 mL ddH20
(2)MMG 溶液(10 mL)
0. 2 mL MES (0. 2 M pH 5. 7),5 mL Mannitol (0. 8 Μ)，0· 15 mL MgCl2 (I Μ)，4· 65 mLddH20
(3)PEG/Ca2+溶液(10mL)
4g PEG 4000,2. 5 mL Mannitol (0.8 Μ), I mL CaCl2 (I M)，3 mL ddH20。拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化
MMG溶液重悬原生质体，定量至1-2 X IO5个/mL
在一个2 mL的圆底EP管加入10 μ DNA (5 kb大小的质粒DNA 10 2(^g)，加入100KL原生质体(2 X IO4个原生质体)，混匀；
再加入110 μ PEG/Ca2+溶液，混匀；
暗处放置15 min后用440 μ W5溶液稀释，并轻轻混匀，800 rpm离心2 min，去上清； 加入WI溶液，分散原生质体，平铺于6/12/24孔板中培养过夜。瞬时转化的确认提取纯化转化后原生质体的蛋白，进行蛋白电泳及western blot,确认转化至原生质体的基因是否有表达。在拟南芥原生质体中瞬时转化GFP载体后，经过过夜培养，收集原生质体，在血球计数板上盖上盖玻片，将原生质体从侧面吸入计数室，在荧光显微镜下观察。根据发绿色荧光的原生质体与所有原生质体数目的比值来统计转化率，观察结果如图4所示。从图中可知原生质体的转化率可达90%以上。NPQl-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达GFP和NPQl-GFP融合蛋白，过夜培养，收集原生质体，800 rpm转速离心，吸出多余培养液,将剩余培养液与原生质体混匀，按每孔100KL量分装于96孔板。待所有样品分装完成，将96孔暗适应10 min后测定叶绿素荧光参数。实验结果如图5所示。图中，A.原生质体瞬时过表达GFP、NPQl-GFP后各自的1/4 NPQ荧光成像图，为六组重复取三组原生质体瞬时过表达GFP、NPQ1-GFP后各自所测得的NPQ 数值，数值为六组重复取平均值，< O. 01; -test ；C. Western blot检测瞬时表达的GFP和NPQl-GFP蛋白，上图是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下图是CBB染色的PVDF膜，星型标记表示非特异性条带，RbcL是核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶的大亚基。数据表明过表达NPQl-GFP融合蛋白的原生质体，其NPQ高于过表达GFP蛋白原生质体的NPQ。数值分别为O. 37和O. 21 (图5A，5B)。收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和westernblot检测。Western blot结果显示用抗GFP的抗体可以检测出GFP和NPQl-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达(图5 C)。这些结果显示原生质体经过瞬时转化，仍然具有光合活性和生理功能，适合于叶绿素荧光参数测定。ATPCI-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
为了更加充分地证明瞬时过表达外源基因的原生质体能用于叶绿素荧光参数测定，选取另一个已报道过的，其稳定过表达植株的叶绿素荧光参数会发生变化的基因477^7进行实验。先在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达GFP和ATPC1-GFP融合蛋白，过夜培养，收集原生质体，800 rpm转速离心，吸出多余培养液,将剩余培养液与原生质体混匀，按每孔100 μ 量分装于96孔板。待所有样品分装完成，将96孔暗适应10 min后测定叶绿素荧光参数。实验结果如图6所示。图中，A.原生质体瞬时过表达GFP、ATPC1-GFP后各自Fv/Fm的荧光成像图及对应的数值；B.原生质体瞬时过表达GFP、ATPC1-GFP后各自OPSII的荧光成像图及对应的数值；C. Western blot检测瞬时表达的GFP和ATPC1-GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基；D.原生质体瞬时过表达GFP (20 μδ) ,ATPCI-GFP (0、5、10,15,20 μδ)后各自OPSII的荧光成像图及对应的数值；Α、B中荧光成像图为六组重复中取三组，对应数值为六组重复取平均值；D中荧光成像图为四组重复取一组，对应数值为四组重复取平均值；< 0. 05, ^ 0. 01; i-testo比较过表达ATPC1-GFP融合蛋白的原生质体与过表达GFP的原生质体。前者的匕/^与CDPSII均高于后者，数值分别为Fv/Fm (0.67与0.58)(图6A)，ΦΡΞΙΙ (0. 35与0. 28)(图 6Β)。
为了证明瞬时转化ATPC1-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数Fv/Fm与ΦΡ5ΙΙ增高是由ATPCl过表达造成的，将35S:ATPC1-GFP融合质粒DNA的量设置一个梯度后转化原生质体。在100 μ 反应体系中，当35S:ATPC卜GFP的量低于10 μδ时，转化效率很低，与对照即转化20 μg质粒的原生质体相比，它们的OPSII几乎一致(图6D)。当转化15或20 Pg质粒时，原生质体的Φ PSII显著高于对照(图6D)。并且ΦΡΞΙΙ的数值随着ATPCI-GFP融合蛋白量的增加而增加(图6D，Ε)。
收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和westernblot检测。Western blot结果显示用抗GFP的多克隆兔抗可以检测出GFP和ATPC1-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达(图6C)。以上结果表明瞬时过表达ATPCl融合蛋白的原生质体其叶绿素荧光参数FyF111,φρεπ发生改变的确是由ATPCi蛋白过表达所造成的。ATPCl-c-myc瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
考虑到有些蛋白与GFP融合表达后会散失功能，为了尽可能降低这种影响，有时会直接表达蛋白，或是将蛋白与较小的标签融合表达，如HA，c-myc，6XHiS，FLAG等。为了进一步证明上一部分实验中原生质体叶绿素荧光参数发生改变的原因确实是ATPCl基因过表达。将ATPCl连入改造过的pUC-c-myc中，构建载体ATPCl-c-myc，选择生态型为Col-O和No-O的野生型拟南芥，制备原生质体，瞬时过表达ATPCl与10个氨基酸的多肽融合的ATPCl-c-my,同时瞬时转化c_myc作为对照。实验结果如图7所示。图中A. No-0，Col-O生态型拟南芥原生质体瞬时过表达c-myc、ATPCl-c-myc后各自Fv/Fm的荧光成像图及对应的数值；B. No-0, Col-O生态型拟南芥原生质体瞬时过表达c-myc、ATPCl-c-myc后各自OPSII的荧光成像图及对应的数值；A-B，荧光成像图为六组重复取两组，对应的数值为六组重复取平均值，**/ ^ O. 01;
test ο实验结果显示在这两个生态型拟南芥的原生质体中瞬时过表达ATPCl-c-myc后，相比对照，原生质体的Fv/Fm与ΦPSII均比对照高(图7A，7B)，与转化瞬时过表达ATPCI-GFP的原生质体一致。四、光合作用相关功能基因的快速筛选
根据已有研究的报道DTT处理叶盘，会使其NPQ显著下降(Bilger et al.，1989;Kalituho et al.，2007)。用浓度递增的DTT溶液((TlO mM)处理拟南芥叶盘和原生质体，也获得了一致的结果。由于DTT是一种还原型物质，且能打开蛋白质的二硫键，推论拟南芥的NPQ，OPSII可能受氧化还原作用的调控，进一步推论NPQ，OPSII可能会受叶绿体氧化还原系统的调控。拟南芥叶绿体氧化还原系统中硫氧还蛋白(TRXs)被分为7组(2f, llh, 4m, 2o,lx,2y和lz),其中5组4m, 2f, lx, 2y和Iz被认为是质体/叶绿体定位的硫氧还蛋白(Gelhaye et al. , 2005; Meyer et al. , 2005; Arsova et al. , 2010)。叶绿体中起主要调节作用的硫氧还蛋白是TRX m和f，它们通过受铁氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶(FTR)介导，受还原型铁氧还蛋白(Fd)激活(Gelhaye et al. , 2005; Meyer et al. , 2005;Schurmann and Buchanan, 2008; Arsova et al. , 2010)。在原生质体中瞬时过表达了 4个TRX m和2个TRX f，测定叶绿素荧光参数。进而筛查了其上游的FTR和Fd，研究这些基因是否参与光合作用光反应中心的氧化还原调控。实验方法
DTT处理拟南芥叶肉细胞原生质体
配制6个梯度为0、2、10、20、40、100 mM的DTT溶液，将其分别加入96孔板中，每孔10μι。随后，在各孔中加入原生质体90 μ ,混合均匀，使原生质体溶液中DTT的终浓度分别为:0,0. 2、1、2、4、10 mMoDTT处理拟南芥叶盘 用2 mM MES溶液配制6个梯度为0、0. 2、1、2、4、10 mM的DTT液。用直径为6 mm的打孔器从四周龄的拟南芥叶片上打下叶盘，迅速放入配置好的DTT溶液中，暗处理20 min。处理完后，用去离子水洗去叶盘表面残留的DTT，在Imaging-PAM的测量板上铺好叶盘，暗适应10 min,测定叶绿素突光。激光扫描共聚焦显微镜拍摄
目的基因在原生质体中瞬时表达后，收集原生质体，用激光扫描共聚焦显微镜(LeicaTCS SP5 A0BS)进行观察，并用Leica Microsystem LAS AF软件显示与输出图像。GFP和叶绿素自发荧光(chi)使用488 nm波长的激光激发，使用500-530 nm收集GFP信号，用650-750 nm收集叶绿素自发荧光。所有的荧光观察实验至少独立重复三次。DTT分别处理野生型拟南芥叶盘和原生质体后叶绿素荧光参数的比较 配制6个浓度梯度的DTT溶液，分别为:0、0.2、1、2、4、10 mM。将拟南芥叶盘浸泡在DTT溶液中20 min后，取出叶盘，用水洗去叶盘表面的DTT。暗适应后测定叶绿素荧光参数，实验结果如图8所示，图中，A用不同浓度(0、0.2、1、2、4and 10 mM)的DTT溶液处理拟南芥叶盘所测得的叶绿素荧光参数ΦΡΞΙΙ的荧光成像图和对应的数值；B 1/4 NPQ的荧光成像图和对应的数值；C用不同浓度(0、0. 2、1、2、4 and 10mM)的DTT溶液处理拟南芥叶肉细胞原生质体所测得的叶绿素荧光参数ΦΡΞΙΙ的荧光成像图和对应的数值；D 1/4 NPQ的荧光成像图和对应的数值；荧光成像图为六组重复取一组，对应的数值为六组重复取平均值。由实验数据发现叶盘的NPQ会显著降低，ΦΡ3ΙΙ会显著升高(图8A，B)。用同样浓度梯度的DTT处理原生质体后测叶绿素荧光参数，发现原生质体的NPQ也会随着DTT浓度的升高而降低，OPSII则随着DTT浓度的升高而升高(图8 C，D)。TRX ml、TRX m2、TRX m3、TRX m4_GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析 为了研究拟南芥叶绿体中起主要调节作用的硫氧还蛋白是否参与调控NPQ和OPSII，
先分别在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达了 4个m类的硫氧还蛋白(TRX ml-GFP,TRX m2-GFP, TRX m3_GFP和TRX m4_GFP)，测定过表达原生质体的叶绿素荧光，检测它们是否会造成原生质体的叶绿素荧光参数OPSII和NPQ发生改变。实验结果如图9所示，图中 A.瞬时过表达 GFP、TRX ml-GFP、TRX m2_GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP 后，原生质体叶绿素荧光参数OPSII的荧光成像图及其对应的数值；B.瞬时过表达GFP、TRX ml-GFP,TRXm2-GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值;A-B，荧光成像图为六组重复取三组，对应的数值为六组重复取平均值。
经过6次以上生物学重复，实验结果表明尽管可以通过荧光显微镜检测到4个m类硫氧还蛋白与GFP融合蛋白表达后的荧光，也就是说这四个蛋白能在原生质体中表达。但是，他们在原生质体中分别瞬时过表达后均没有显著改变原生质体的叶绿素荧光参数(图 9)。TRX H、TRX f2_GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
瞬时过表达m类硫氧还蛋白后测量原生质体的叶 绿素荧光参数，发现它们过表达后叶绿素荧光参数没有发生显著改变。在此基础上，为了了解另一类主要的硫氧还蛋白f类的硫氧还蛋白是否会通过氧化还原作用影响原生质体的叶绿素荧光参数OPSII和NPQ，在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达2个f类的硫氧还蛋白(TRX fl-GFP和TRX f2_GFP)，测定过表达后原生质体的叶绿素荧光。实验结果如图10所示，图中，A.瞬时过表达GFP和TRX Π-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ΦΡΞΙΙ的荧光成像图及其对应的数值；Β.瞬时过表达GFP和TRX fl-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；C.瞬时过表达GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ΦΡΞΙΙ的荧光成像图及其对应的数值；D.瞬时过表达GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；E. Western blot检测瞬时表达的TRX fl-GFP, TRX f2_GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基;A-D，荧光成像图为六组重复取三组，对应的数值为六组重复取平均值，*/7 ( O. 05, **/7 O. 01; i-testo结果表明，瞬时过表达TRX Π-GFP和TRX f2_GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ΦΡε Ι和NPQ与DTT处理后发生改变的趋势一致。相比过表达GFP的对照，过表达TRXfl-GFP, TRX f2-GFP的原生质体其ΦΡ3ΙΙ有所升高(图10A、C)，NPQ有所降低(图10B、D)。为了证明原生质体叶绿素荧光参数OPSII升高是由TRX f过表达引起，首先将35S-.TRX fl-GFP融合质粒DNA的量设置4个梯度5、10、15和20 μ g，转化原生质体。在100 μ 原生质体体系中，当35S: TRX fI-GFP的量低于10 Pg时，转化效率很低，只能检测到很少量的TRX fl-GFP蛋白，与对照即转化20 μg质粒的原生质体相比，它们的OPSII几乎一致。当转化15或20 Pg质粒时，原生质体的Φ PSII显著高于对照(图11A)。对于拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统，100 μ 原生质体的体系中，20 Pg质粒转化2 X IO4个原生质体的转化效果通常为最好。为了进一步证实TRX f在原生质体中瞬时过表达会造成原生质体OPSII增加，将融合质粒DNA的量设置另外4个梯度7. 5、15、22. 5和30 μ g，转化原生质体。实验结果显示转化22. 5 Ug质粒的原生质体，其ΦΡ3ΙΙ最高，转化15和30 Ug质粒的原生质体，其ΦΡ3ΙΙ都有所降低(图11B)。收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和westernblot检测。Western blot结果显示用抗GFP的一抗以及相应二抗孵育后，可以检测出GFP和TRX fl-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达。结果显示对于100 PL的原生质体体系，转化质粒的最佳用量约为20 Pg，此时融合蛋白的表达量最高，质粒量的增加或减少都会降低转化率。而原生质体叶绿素荧光参数◎PSII会随着TRX fl-GFP融合蛋白表达量增加而增加(图11C，D)。以上结果可以共同说明瞬时过表达TRX fl-GFP融合蛋白的原生质体其叶绿素荧光参数OPSII增加的确是由TRX fl蛋白过表达所造成的。Fdl-GFP, Fd2_GFP、FTRc-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
由于 TRX f 被 FTR 还原，FTR 被 Fd 还原(Schurmann and Buchanan, 2008),也就是说FTR和Fd处于TRX f的上游。为了明确瞬时过表达TRX f上游的蛋白是否会引起叶绿素荧光参数发生相同的改变，选取了两个叶中表达的Fd :Fdl和Fd2，以及FTR的催化亚基FTRc，将它们在原生质体中瞬时过表达。实验结果如图12所示，图中，A.瞬时过表达GFP，FTRc-GFP和TRX f2_GFP后，
原生质体叶绿素荧光参数OPSII的荧光成像图及其对应的数值；B.瞬时过表达GFP，FTRc-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；C.瞬时过表达GFP，Fdl-GFP, Fd2_GFP，TRX Π-GFP和TRX f2_GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ΦΡΞΙΙ的荧光成像图及其对应的数值；D.瞬时过表达GFP，Fdl-GFP, Fd2_GFP，TRXf I-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；E.Western blot检测瞬时表达的Fdl-GFP，Fd2_GFP，FTRc_GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶的大亚基;A_D，荧光成像图为六组重复取两组，对应的数值为六组重复取平均值，
^ O. 05,林/7 ^ O. 01; i—test。结果显示尽管过表达TRX fl-GFP，TRX f2_GFP的原生质体，其ΦΡΞΙΙ会显著上升，NPQ会显著下降(图12Α，B，C，D)，却没有发现过表达Fdl和Fd2，以及FTRc的原生质体的叶绿素荧光参数，如NPQ或者ΦΡ3ΙΙ发生明显地改变(图12A，B，C，D)。ffestern-blot结果显示，GFP，FTRc-GFP, Fdl-GFP和Fd2_GFP能够在原生质体中正常表达(图12E)。说明f类硫氧还蛋白通过氧化还原作用直接调控NPQ和ΦΡ5ΙΙ，由于f类硫氧还蛋白在植物体内的含量较稳定，瞬时过表达f类硫氧还蛋白的上游基因不起作用，也存在另一种可能，即这些蛋白与GFP融合表达后散失了功能。尽管如此，利用新方法，将拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化技术与叶绿素荧光技术结合起来，所获得的结果提示TRX fl和TRX f2可能是氧化还原调控NPQ和OPSII的两个潜在硫氧还蛋白。Fdl、Fd2、FTRc、TRX fl、TRX f2 的亚细胞定位
为了确保叶绿素荧光参数发生改变的原因是外源基因的瞬时过表达，必须要有检测目的基因已经发生了过表达的方法，比如，通过western blot，用抗GFP的抗体检测目的基因与GFP融合蛋白的表达。还可以利用荧光显微镜观察目的基因与GFP融合蛋白的荧光，瞬时转化TRX fl-GFP, TRX f2_GFP，FTRc_GFP，Fdl-GFP，Fd2_GFP，用激光共聚焦显微镜可以检测到这5个基因成功表达，且定位在叶绿体中(图13)。可见，本发明方法可以很好地应用于光合作用的研究。基于上述实验，可以明确地预见,将反义RNA转入原生质体中，使原生质体中的正常表达基因瞬时沉默，同样可以应用于光合作用的研究。
权利要求
1.一种研究光合作用相关功能基因的方法，包括如下步骤 1)制备含有叶绿体的原生质体，并将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体并确认待测基因可瞬时表达和/或反义核酸序列已使基因表达瞬时沉默； 2)将转入有待测基因和/或反义核酸序列的原生质体和对照原生质体进行暗适应处理； 3)将暗适应处理的原生质体进行光照处理，获取其荧光图像和/或荧光参数，或基于荧光图像和/或荧光参数绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线和/或光诱导曲线； 4)对比不同处理组的荧光图像、荧光参数、叶绿素荧光诱导动力学曲线、光诱导曲线中的至少一种，判断待测基因和/或反义核酸序列对光合作用的影响，确定其是否为光合作用相关基因。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于转入原生质体的待测基因和/或反义核酸序列至少为一种。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于暗适应处理的时间为8 12min。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于测定叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线的程序为 1)打开不足以使原生质体进行光合作用的微弱测量光，测得最小荧光Ftl； 2)随后施加一个饱和脉冲，关闭所有的电子门，暂时抑制植物的光合作用，得到最大荧光Fm; 3)打开光化光，使原生质体光合作用，施加饱和脉冲后，得到的叶绿素荧光为光化光下最大突光Fm’ ； 4)待饱和脉冲处理后，叶绿素荧光值达到稳态之后，关闭光化光，同时打开远红光，使电子门回到开放态，F回到最小荧光Ftl附近，此时得到的荧光为Ftl'
5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于原生质体为拟南芥叶肉细胞原生质体。
全文摘要
本发明公开了结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用。通过在原生质体中瞬时表达或沉默一个或多个基因，之后利用调制叶绿素荧光成像仪测定拟南芥叶肉细胞原生质体叶绿素荧光变化，并对其图像进行对比，可以快速、高通量地筛选出与光合作用相关的基因。
文档编号C12Q1/68GK102758018SQ201210265108
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者冯冬茹, 刘兵, 段珊, 王宏斌, 王金发, 苏建斌 申请人:中山大学