专利名称：定量检测人乳腺癌特异性基因1 mRNA表达水平的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种定量检测人乳腺癌特异性基因ImRNA表达水平的试剂盒。
背景技术：
乳腺癌作为ー种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命和健康。因地理环境、生活习惯等的不同，乳腺癌在世界各国的发病率有很大差异，北美和北欧的大多数国家为高发区，南美和南欧ー些国家为中等，亚洲、拉丁美洲和非洲的大多数国家为低发区。在北美、两欧等发达国家，女性乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤发病率的首位。据美国癌症协会估计，美国毎年有12万乳腺癌新发病例，发病率为72. 2/10万。我国虽属世界上女性乳腺癌的低发区，但近年来乳腺癌的发病率明显增高。我国各地区乳腺癌的发病率也不相同，沪、京、津 及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区，2006年我国乳腺癌发病率为52/10万，居女性恶性肿瘤中的第一位。乳腺癌的治疗方法有多种，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗等。目前，手术切除为乳腺癌综合治疗方法中的首选，然而在手术切除技术已达到相当成熟和普及的同吋，乳腺癌切除后的高复发和转移率已成为阻碍乳腺癌患者生存期提高的主要原因。手术前乳腺癌细胞由于自然或侵袭性医源性因素脱落至外周血井随血液转移至乳腺外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降吋，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，随血液循环返回到乳腺，并在乳腺内恢复増殖，从而导致了乳腺癌的复发。肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的ー个重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学(X线、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。影像学检查中，病灶或转移灶需要形成一定大小才能够被仪器成像和有效分辨；病理形态检查中，需要取到合适的检测标本，且有相当数量可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移的早期，能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的ー种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力，因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和ー些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。循环肿瘤细胞中特异性基因mRNA的定量測定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入ー对引物的同时加入ー个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的TaqMan荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和ー个淬灭突光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’ -3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是ー种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。乳腺癌特异性基因I (Breast cancer-specific gene 1，BCSG1)是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其定位于人类染色体10q23，DNA长度约5kb。BCSGl基因编码合成I条含127个氨基酸的蛋白，其在乳腺癌组织中特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是ー种与乳腺癌进展有关的肿瘤标记物。正常人外周血BCSGl mRNA呈阴性；游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被RNA酶解，故在外周血中若测得BCSGl mRNA,则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞。因此，BCSGl mRNA是ー项较好的血源性乳腺癌 细胞的监测指标。检测乳腺癌患者骨髄及血中的BCSGl mRNA对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技木。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一种用于检测人乳腺癌特异性基因I (BCSGl)mRNA表达量的试剂盒，所述试剂盒中含有由序列表序列I所示的一条引物和序列表序列2所示的另一条引物组成的引物对。所述试剂盒中还可含有核苷酸序列如序列表序列3所示的探针，所述探针具体可为Taqman探针。所述试剂盒中还可含有尿嘧啶DNA糖基化酶。所述试剂盒中还可含有如下组成的PCR反应缓冲液由终浓度为17. 9-19. 5mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2. 55-2. 90mmol/L的氯化镁和终浓度为90. 0-96. 3mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。所述试剂盒中还可含有如下组成的PCR反应液由所述PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、所述引物对、所述探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水。所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度具体可为O. 9 μ I/ μ I ;所述DNA聚合酶在所述PCR反应液中的浓度可为O. 08-0. 14U/μ 1，如O. 08、0. I或
O.14U/y I ；所述dATP在所述PCR反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400或420nmol/L ；所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400或420nmol/L ；所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400或420nmol/L ；所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度可为180-215nmol/L，如180、200或215nmol/L ；所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400或420nmol/L ；每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度可为O. 28-0. 42 μ mol/L，如O. 28、O. 37或 O. 42 μ mol/L ；所述探针在所述PCR反应液中的浓度可为O. 17-0. 25ymol/L，如O. 17、0· 20或
0.25μmol/L ；所述尿嘧啶DNA糖基化酶在所述PCR反应液中的浓度可为O. 0150-0. 0180U/ μ 1，如 O. 0150,0. 0167 或 O. 0180U/y I。所述试剂盒中还可含有反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成终浓度为 8. 0-9. 8 μ mol/L (如 8· 0、9· I 或 9· 8 μ mol/L)的 Oligo (dT) 12_18、终浓度为 3· 15-4. OU/μ I (如 3· 15,3. 6 或 4· OU/μ I)的 RNA 酶抑制剂、终浓度为 70. 0-76. OmmoI/L (如 70. O、72. 7 或 76. 0mmol/L)的ニ硫苏糖醇、终浓度为 170-195mmol/L (170、182、或 195mmol/L)的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为255-290mmol/L (如255、273或290mmol/L)的氯化钾、终浓度为9. 25-12. 5mmol/L (如9. 25,11或12. 5mmol/L)的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。所述试剂盒中还可含有反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度具体可为0. 786 μ I/ μ I ;所述dATP在反转录反应液中的浓度可为I. 30-1. 60mmol/L,如I. 30,1. 43或
1.BOmmoI /I,；所述dCTP在反转录反应液中的浓度可为I. 30-1. 60mmol/L,如I. 30,1. 43或I. BOmmoI /I,；所述dGTP在反转录反应液中的浓度可为I. 30-1. 60mmol/L,如I. 30,1. 43或I. BOmmoI /I,；所述dTTP在反转录反应液中的浓度可为I. 30-1. 60mmol/L,如I. 30,1. 43或
I.BOmmoI /I,；所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度可为11. 5-16. 5U/y 1，如11. 5、14. 3或16.5U/μ I ο所述逆转录酶具体可为莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶。实验证明，临床确诊乳腺癌并已发生远端转移的病例用本发明试剂盒可以检出阳性(表I結果)；临床上不能确诊是否已转移的乳腺癌病例用本发明方法也可检测出部分阳性(表2結果)；临床上确诊应为阴性的，本发明试剂盒检测也为阴性(对照组结果)，所以本发明试剂盒的准确性及特异性好，且比目前临床检验方法能更早地发现乳腺癌细胞的扩散，表明本发明的试剂盒可对BCSGl mRNA的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高，可达100%。本发明试剂盒检测全血的灵敏度为100拷贝/ml全血。本发明的试剂盒可实时监测乳腺癌患者骨髄及血中的BCSGl mRNA表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，应用前景广阔。
图I为标准品的荧光定量PCR检测結果。图2为标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，在利用实时荧光定量PCR检测BCSGl基因表达水平的同时，另单管·检测样品中内參基因β -actin的表达量，以确证RNA样品及逆转录反应是否有问题,并可计算各样品中BCSGl基因相对于β-actin基因的表达水平。正常情况下，每毫升血液中β -actin基因的表达量在IO7拷贝以上，若β -actin基因的表达量小于IO5拷贝/毫升，则说明RNA样品或逆转录反应存在问题，需重新取样进行RNA样品的制备和检测。β-actin基因的引物对序列为pi:5， -TTG CCG ACA GGA TGC AGA A_3’ ；p2:5， -GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT-3，；探针序列为5’-FAM-TCA TTG CTC CTC CTG AGC-TAMRA-3’ ；扩增产物的长度为10 Ibp。β-actin基因的使用详见发明人已发表文章Min Cheng, Yongyan Chen, XiaoqinYu，Zhigang Tian and Haiming Wei. Diagnostic utility of LunX mRNA in peripheralblood and pleural fluid in patients with primary non-small cell lung cancer. BMCCancer. 2008，8:156。实施例I、定量检测人乳腺癌特异性基因ImRNA表达水平的试剂盒试剂盒的组成及其制备方法如下I、红细胞裂解液溶剂为水，溶质及其在红细胞裂解液中的浓度分别为氯化铵I. 52mol/L，碳酸氢钾0. lmol/L和こニ胺四こ酸ニ钠0. Olmol/L。红细胞裂解液在25°C条件下，pH值为7. 2。2、无RNA酶的水向去离子水中加入焦碳酸ニこ酯(DEPC，购自Biobasic公司)，至终浓度为0. 05%(体积百分含量)，22-25°C放置10-12小时后，121°C高压灭菌20分钟，22_25°C放置，备用。3、RNA 提取液为Trizol 试剂。4、dNTP 混合物含(^了？、(101\( ^\(111 ，具体以其钠盐-水溶液形式保存，25で条件下，？!1值为
7.0-7. 5，四种dNTP在混合物中的终浓度均为10mmol/L。5、逆转录酶储存液逆转录酶具体是M-MLV逆转录酶，购自宝生物工程(大连)有限公司。逆转录酶具体以其储存液形式保存，储存液由终浓度为20mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为100mmol/L的氯化钠、终浓度为O. lmmol/L的こニ胺四こ酸、终浓度为I. Ommol/L的ニ硫苏糖醇、终浓度为50% (体积百分含量)的甘油、终浓度为O. 01% (体积百分含量)的Nonidet p-40组成，溶剂是水；逆转录酶在储存液中的终浓度为200U/μ I。逆转录酶在25 °C条件下，pH值为7. 5。6、反转录缓冲液由终浓度为9. I μ mol/L的Oligo (dT) 12_18、终浓度为3. 6U/ μ I的RNA酶抑制剂、終浓度为72. 7mmol/L的ニ硫苏糖醇、终浓度为182mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为273mmol/L的氯化钾、终浓度为llmmol/L的氯化镁组成，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。反转录缓冲液在25°C条件下，pH值为8. 3。7、反转录反应液 反转录反应液由反转录缓冲液、dNTP、逆转录酶组成。具体可以是将上述反转录缓冲液、dNTP混合物和逆转录酶储存液按比例混合而成。所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为O. 786 μ 1/μ I ；所述dATP在反转录反应液中的浓度为I. 43mmol/L ；所述dCTP在反转录反应液中的浓度为I. 43mmol/L ；所述dGTP在反转录反应液中的浓度为I. 43mmol/L ；所述dTTP在反转录反应液中的浓度为I. 43mmol/L ；所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为14. 3U/ μ I。8、引物对Pl (上游引物):5’ -GGGTGAGGCATCCAAAGAGA-3’(序列表序列 I 所示)；Ρ2(下游引物):5’ -TGGGCAGCCGCATGTC-3’(序列表序列 2 所示)。引物可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，lmmol/Lこニ胺四こ酸和水)，引物浓度为5 μ mol/L。9、探针5’ -FAM-AGAGGAAGTGGCAGAGGAGGCCCA-TAMRA-3’(序列表序列 3 所示)。探针可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为lOmmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、lmmol/Lこニ胺四こ酸和水)，探针的浓度为2 μ mol/L。上述引物和探针是以BCSGl全长cDNA序列(GenBank登录号为NM003087. 2)为模板，使用ABI7000型实时荧光定量PCR仪随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑BCSGl基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合得到的。上述引物和探针由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成。10、PCR反应缓冲液由终浓度为18. 5mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2. 78mmol/L的氯化镁和终浓度为92. 6mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。11、PCR 反应液由所述PCR反应缓冲液、Taq酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、引物对、探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；
所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为O. 9 μ I/ μ I ;所述Taq酶在所述PCR反应液中的浓度为O. IU/ μ I ；所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L ；所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L ；所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L ；所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为200nmol/L ；所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L ；
每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为O. 37 μ mol/L ；所述探针在所述PCR反应液中的浓度为O. 20 μ mol/L ；所述UNG酶在所述PCR反应液中的浓度为O. 0167U/ μ I。PCR反应液在25°C条件下，pH值为8. 3。12、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液UNG酶以储存液形式保存；UNG酶储存液由终浓度为50% (体积百分含量)的甘油、由终浓度为30mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、由终浓度为150mmol/L的氯化钠、由终浓度为I. Ommol/L的こニ胺四こ酸、由终浓度为I. Ommol/L的ニ硫苏糖醇、由终浓度为0. 05% (体积百分含量)的TWeen20、由终浓度为IU/μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶组成；溶剂是水；各物质的浓度均是其在尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液中的终浓度。UNG酶储存液在25°C条件下，pH值为7. 5。12、标准品标准品为终浓度为2 X IO7拷贝数/ μ I的pMD18-BCSGl-166重组质粒，TE溶液溶解(TE溶液的组成为lOmmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，lmmol/Lこニ胺四こ酸，水)。pMD18-BCSGl-166重组质粒中插入的BCSGl片段(名称为BCSG1-166)的DNA序列如序列表序列4所示。pMD18-BCSGl-166重组质粒的构建方法如下I、细胞总RNA的提取I)将人乳腺癌细胞SK-BR-3，用DMEM完全培养基(Gibco公司)按常规方法进行培养。2)将培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶(质量百分含量)消化，IOOOrpm离心收集细胞，转移至IJ I. 5mL离心管中，每管IXlO6个细胞。3)提取细胞总RNA，具体过程如下①.向细胞沉淀中加入I. 0ml RNA提取液，上下颠倒使细胞完全裂解，并将溶液转移至I. 5ml无RNA离心管中。②.加入200 μ I氯仿，剧烈摇动15秒，冰上放置3分钟。③.4°C，12000g，离心15分钟。吸取上清液至新的无RNA酶离心管中，注意不要吸取到中间层，每管加入500μ I异丙醇，反复颠倒3 5次，冰上放置10分钟。④.4°C，12000g，离心10 分钟。⑤·弃Ep管中的液体,加入75%こ醇Iml,颠倒2 3次。4°C, 7500g,离心5分
钟。重复洗涤一次。
⑥.弃管中液体，使用离心机短暂离心收集，吸尽管中液体，室温下倒置5分钟，こ醇挥发之后，加入50 μ I的无RNA酶的水，溶解RNA，轻弹管底，促进溶解，室温溶解3分钟，冰上放置,备用。2、逆转录反应反转录体系为反转录反应液3. 5μ I、总RNA溶液4. 0μ I、无RNA酶的水2. 5μ I。反转录反应条件为37°C，20分钟一95°C，5分钟。反应结束后，取出离心管置于冰盒上。3、PCR 扩增
用TaKaRa公司的普通PCR扩增试剂盒，參照试剂盒说明书进行操作。PCR反应体系为反转录产物5 μ I、10XPCR缓冲液5. O μ I、dNTP混合物4. O μ I、上、下游引物(Ρ1、Ρ2)各 2. O μ I、Taq 酶 O. 5 μ I、水 31. 5 μ I。PCR反应条件为先94°C、3分钟一再94V、30秒，60°C、45秒，72°C、50秒，共35个循环一最后72°C、7分钟。4、BCSG1_166扩增产物的获得I)将PCR扩增产物进行I. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含166bp目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照IOOmg=IOOy I的比例确定胶的体积。2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自上海英俊生物技术有限公司)回收扩增产物①.按照试剂盒说明书中的比例在回收胶中加入DE-A液，60°C加热至完全熔化。②.加入O. 5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20%。③.将上述液体转入制备管中，5500rpm离心I分钟，弃滤液。④.加入O. 5mL缓冲液Wl后，5500rpm离心I分钟，弃滤液。⑤.加入O. 7mL缓冲液W2, 5500rpm离心I分钟，弃滤液。⑥.再加入O. 7mL缓冲液W2, 5500rpm离心I分钟，弃滤液；12000rpm,离心I分钟，以甩干滤膜基质。⑦.将制备管置于新的I. 5mL离心管中，在滤膜中央加入25 μ I水，室温静置I分钟后，12000rpm,离心I分钟洗脱DNA。得到纯化后的PCR扩增产物。5、BCSG1_166的克隆及鉴定I)重组载体的构建①·10μ I 体系中，加入 1μ I T 载体(pMD18_T Vector)(TaKaRa)，4 μ I 步骤 4 纯化后的PCR扩增产物，加入5 μ I连接缓冲液(IOOmmoI/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、15mmol/L氯化镁、I. Ommol/L三磷酸腺苷、20mmol/L ニ硫苏糖醇(Invitrogen)、IU/ μ IDNA连接酶。连接缓冲液在25°C条件下，pH值为7. 5。)，16°C反应14小吋。②.取5μ I连接产物，加入到100μ I大肠杆菌DH5a感受态细菌中，混匀后冰浴40分钟，置于42°C水中热休克90秒；冰浴，2分钟。③.加入无抗生素的LB培养基400 μ 1，于37°C摇床上以150rpm的速度混合振摇45分钟后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37°C平放20分钟后，倒置培养12小时。2)重组载体的鉴定①.观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mL LA培养基的大试管中，编号后置37°C摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD6tltl ^ O. 4。②.取I. 5mL培养物至离心管中，4°C，IlOOOrpm离心30秒，弃尽上清液。③.100μ I 预冷的裂解液 I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris · Cl (pH8. O,25°C ), 10mmol/L EDTA (pH8. 0，25°C )，水)重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200 μ I新配制的裂解液II (200mmol/l NaOH, 1%SDS，水)，混匀后，冰浴3分钟，再加入150 μ I预冷的裂解液III(3mol/L醋酸钾；pH5. 2，25°C )，颠倒混匀后冰浴3-5分钟；4°C, IlOOOrpm离心5分钟后将上清转移至另ー离心管中。④.加入等体积的酚/氯仿(I: I)，振荡后4°C，IlOOOrpm离心2分钟，再将上清转
移至另ー离心管。⑤.加入1/10体积的3M NaAc溶液和2. 5倍无水こ醇，混匀后，室温静置10分钟， 4°C，IIOOOrpm离心10分钟后弃上清。⑥.加入lmL70%こ醇，振荡漂洗后4°C，IlOOOrpm离心2分钟；弃去上层液体。⑦.加入少量无水こ醇，4°C, IlOOOrpm离心2分钟，弃去こ醇后，室温倒置10分钟，加入30 μ I蒸馏水溶解质粒DNA。⑧.取适量的质粒DNA作为模板，在引物Pl和Ρ2的引导下，进行PCR鉴定，可扩增出166bp DNA片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。3) BCSG1-166扩增产物的鉴定①.质粒的大量抽提A)取ImL含目的菌落的菌液，加入到30mL LA培养基中，摇床培养至OD6tltl约为
O.6。B)取25mL上述菌液接种至300mL LA培养基中，37°C，250rpm培养10-14小时，然后4°C, 4500rpm, 20分钟离心收菌。C)用 200mL 预冷的 STE (10mmol/L Tris-HCl (PH8. 0,25 °C ), O. lmol/L NaCl,lmmol/L EDTA (PH8. 0,25°C )，水)重悬菌体，4°C，4500rpm，20 分钟离心收菌。D)加入 9mL Solution I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris · Cl (pH8. 0,25°C), I Ommol/L EDTA (pH8. 0，25°C )，水)，混匀，再加入 ImL 用 I Ommo I/L Tris-HCl(pH8. 0)新鲜配制的溶菌酶(10mg/mL),再加入IOmL新鲜配制的Solution II (200mmol/l NaOH,1%SDS,水)，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟。E)加入 7. 5mL 冰冷的 Solution III(3mol/L 醋酸钾；ρΗ5· 2，25°C )，轻轻混匀，冰浴10分钟；4°C，IlOOOrpm离心10分钟，取上清。F)加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，IlOOOrpm离心10分钟，弃上清。G)用70%こ醇洗涤沉淀，8000rpm，15分钟离心回收，用2mL TE溶解沉淀。H)加入2mL5mol/L的LiCl，混匀，IOOOOg离心10分钟，弃去上清。I)用70%こ醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。J)加入300 μ I TER，溶解沉淀，转移至I. 5mL离心管中，37°C水浴ト2小时。K)加入 300 μ I I. 6mol/L NaCl (含 13% 聚こニ醇)，混匀，4。(，12000rpm 离心 15分钟，弃上清。L) 250 μ I TE (ρΗ8. 0)溶解沉淀，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。
Μ)取上清，加入60μ1 I Omo I/L NH4Ac及2倍体积的无水こ醇(或95%こ醇)，混匀，4°C，12000g离心5分钟，弃上清。Ν)120μ 175%こ醇洗涤沉淀，4°C，12000g离心10分钟，弃上清，尽量控干液体，室
温静置至干燥。O)加入100 μ I三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。②.质粒的序列测定对含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列測定，结果重组载体中的插入片段BCSG1-166具有序列表序列4的DNA序列，将该重组载体命名为PMD18-BCSG1-166。将pMD18_BCSGl_166作为标准品。
③将上述抽提得到的质粒PMD18-BCSG1-166用TE溶液溶解(TE溶液的组成为lOmmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，lmmol/Lこニ胺四こ酸，水)至终浓度为2 X IO7拷贝数/μ 。13、质控品阳性质控品为含有BCSGlmRNA的总RNA，其制备方法与标准品制备中提取人乳腺癌细胞SK-BR-3总RNA的方法相同；阴性质控品为正常人外周血总RNA :取离体的正常人的外周血，分离有核细胞，按照标准品制备中提取人乳腺癌细胞SK-BR-3总RNA的方法进行制备；将提取到得两种总RNA分别用无RNA酶的水溶解至终浓度为O. 2μ g/μ 1，取5 μ IRNA样品加入Iml无水こ醇中，_20°C保存。本发明试剂盒中还可包括PCR管(购于美国Applied Biosystems (ABI)公司)等。将上述各组分分装，组合为10人份的试剂盒，每盒中各组分的量为PCR管、红细胞裂解液I瓶(20mL/瓶)、无RNA酶水I瓶(8mL/瓶)、RNA提取液I瓶(IOmL/瓶)、dNTP混合物I管(6. O μ I/管)、逆转录酶储存液I管(3. O μ I/管)、反转录缓冲液I管(33 μ I/管)、PCR反应缓冲液I管(251.75μ I/管)、UNG酶储存液I管(4. 75 μ I/管)、引物对和探针I管(28. 5 μ I/管)、标准品I管(10 μ I/管)、阳性质控品I管(I. O μ g/管)、阴性质控品I管(I. 0μ g/ 管)。实施例2、乳腺癌特异性基因ImRNA表达量的检测用实施例I制备的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的乳腺癌特异性基因ImRNA表达量。实验组33例病理诊断确诊的乳腺癌患者，其中12例临床确诊已发生转移。对照组15例乳腺良性疾病患者，10例健康人。—、实验准备I、将红细胞裂解液按1:9的比例用灭菌去离子水稀释成红细胞裂解液稀释液。2、配制75%的こ醇溶液25mL。ニ、取样取离体的新鲜的受试者静脉血3mL于无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(I. 44mg/mL全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4°C保存1-2小时，但时间不宜过长，否则将影响测定結果。全血经处理后，得到的有核细胞使用RNA提取液裂解后，可于_20°C或_80°C中保存。得到实验组样品和对照组样品。
三、实验组样品和对照组样品的细胞总RNA的提取I)在50ml无菌离心管中，加入3ml新鲜抗凝血液及9ml的红细胞裂解液稀释液，游润振荡混勻。2)冰浴10分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，4°C，1500rpm，离心5分钟沉淀有核细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液。3)用6ml的红细胞裂解液稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞，4°C，1500rpm，离心5分钟，并再次完全弃去上清液。4)用Iml的红细胞裂解液稀释液重悬沉淀的有核细胞，转到无RNA酶的I. 5ml离心管中，4°C，3000rpm，离心3分钟，弃尽上清液。5)向细胞沉淀中加入I. Oml RNA提取液，上下颠倒使细胞完全裂解，并将溶液转移 至I. 5ml无RNA离心管中。6)加入200 μ I氯仿，剧烈摇动15秒，冰上放置3分钟。7)4°C，12000g，离心15分钟。吸取上清液至新的无RNA酶离心管中，注意不要吸取到中间层，每管加入500μ I异丙醇，反复颠倒3-5次，冰上放置10分钟。8) 4°C, 12000g，离心 10 分钟。9)弃Ep管中的液体，加入75%こ醇lml，颠倒2-3次。4°C，7500g，离心5分钟。重
复洗漆一次。10)弃管中液体，使用离心机短暂离心收集，吸尽管中液体，室温下倒置5分钟，乙醇挥发之后，加入50 μ I的无RNA酶的水，溶解RNA，轻弹管底，促进溶解，室温溶解3分钟，冰上放置，备用。得到实验组样品RNA和对照组样品RNA。四、荧光定量PCRI、实验组样品RNA、对照组样品RNA、阳性对照和阴性对照的反转录反应反转录体系反转录反应液3. 5 μ I、总RNA溶液5. O μ I、无RNA酶的水I. 5 μ I。反转录反应条件为37°C，20分钟一95°C，5分钟。反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。得到实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性质控品反转录产物和阴性质控品反转录产物。2、标准品的处理将标准品(2XIO7 拷贝数/μ I)梯度稀释为 2Χ106，2Χ105，2Χ104，2Χ103，2Χ102,2Χ101 拷贝数/μ I。3、荧光定量PCR在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应体系为模板5. O μ I、PCR反应液15. O μ I、水5. O μ I。其中，模板分别为实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性质控品反转录产物、阴性质控品反转录产物和标准品。PCR 反应条件为37V, 10 分钟一95。。，15 分钟一(95°C，15 秒一60。。，I 分钟)。括号内条件共重复45个循环。五、标准曲线的制作标准品突光定量PCR检测结果如图I所示。横坐标为PCR反应的循环数,纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为1X108、1X107、I X ΙΟ6、I X ΙΟ5、I X ΙΟ4、I X ΙΟ3、I X IO2 拷贝数。根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。横坐标为X，代表标准品起始拷贝数的对数值(Logltl),纵坐标为Y，代表Ct值。标准曲线的相关系数为O. 9925，方程为Υ=-3. 356Χ+44. 37。六、检测结果选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数(Μ)。每毫升全血样本中BCSGl m RNA的拷贝数N=MX 6. 6。每毫升全血样本中BCSGl mRNA的拷贝数大于等于100吋，确定为患病阳性。具体结果如下1)12例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表I所示。表I、临床确诊已转移的乳腺癌患者BCSGl mRNA拷贝数的检测结果
权利要求
1.用于检测人乳腺癌特异性基因ImRNA表达量的试剂盒，其特征在于含有由序列表序列I所不的一条引物和序列表序列2所不的另一条引物组成的引物对。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有核苷酸序列如序列表序列3所示的探针。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有尿嘧啶DNA糖基化酶。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如下组成的PCR反应缓冲液由终浓度为17. 9-19. 5mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.55-2. 90mmol/L的氯化镁和终浓度为90. 0-96. 3mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。
5.根据权利要求2-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如下组成的PCR反应液由所述PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、权利要求I中所述引物对、权利要求2中所述探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为O. 9 μ I/ μ I ;所述DNA聚合酶在所述PCR反应液中的浓度为O. 08-0. 14U/ μ I ；所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为180-215nmol/L ；所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为370-420nmol/L ；每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为O. 28-0. 42 μ mol/L ；所述探针在所述PCR反应液中的浓度为O. 17-0. 25 μ mol/L ；所述尿嘧啶DNA糖基化酶在所述PCR反应液中的浓度为O. 0150-0. 0180U/ μ I。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成终浓度为8. 0-9. 8 μ mol/L的Oligo (dT) 12_18、终浓度为3. 15-4. OU/ μ I的RNA酶抑制剂、终浓度为70. 0-76. OmmoI/L的ニ硫苏糖醇、终浓度为170-195mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为255-290mmol/L的氯化钾、终浓度为9. 25-12. 5mmol/L的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。
8.根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为O. 786μ 1/μ I ；所述dATP在反转录反应液中的浓度为I. 30-1. 60mmol/L ；所述dCTP在反转录反应液中的浓度为I. 30-1. 60mmol/L ；所述dGTP在反转录反应液中的浓度为I. 30-1. 60mmol/L ；所述dTTP在反转录反应液中的浓度为I. 30-1. 60mmol/L ；所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为11. 5-16. 5U/y I。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测人乳腺癌特异性基因1 mRNA表达水平的试剂盒。该试剂盒中含有由序列表序列1所示的一条引物和序列表序列2所示的另一条引物组成的特异性引物对，还含有核苷酸序列如序列表序列3所示的特异性探针。本发明试剂盒可对人乳腺癌特异性基因BCSG1 mRNA的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高，可达100%，比目前临床检验方法能更早地发现乳腺癌细胞的扩散；检测全血的灵敏度为100拷贝/ml。本发明的试剂盒可实时监测乳腺癌患者骨髓及血中的BCSG1 mRNA表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK102776287SQ201210264240
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者徐婷娟, 徐维平, 沈国栋, 王卫东, 程民, 胡世莲, 陈永艳, 魏海明 申请人:安徽省立医院