专利名称：定量检测食用油中棕榈油成分检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种定量检测食用油中棕榈油成分检测试剂盒，更进一歩的说是涉及ー种通过荧光定量PCR手段来对食用油中掺入的不同比例棕榈油成分做快速准确的定量鉴定检测的试剂盒。属食品检测领域。
背景技术：
全球食用油主要是以植物油为主，中国作为食用油消费大国，在世界各国食用油消费排名中位居第一。由于各种油脂价格存在差异，一些生产企业为牟取暴利，常在高价食用油中加入低价油、劣质油，如在芝麻油中加入菜籽油或棉子油，或常把原本并没有加入或者含量极小的油脂标上，比如标高色拉油中花生油的含量。目前用于鉴别食用油不同成 分的主要方法为物理和化学方法，但物理、化学检测手段耗费时间人力物カ较多，检测结果无法做精细的定量鉴别，如申请公布号为CN102519953A、申请公布日为2012. 06. 27的发明专利申请《ー种快速鉴定劣质食用油的方法》是通过化学显色反应，目測判断油品成分，仅仅能做定性判断。申请公布号为CN101398412A、申请公布日为2009. 04. 01的发明专利《一种快速鉴别食用油的气相色谱指纹法》是通过气相色谱指纹法来对食用油进行分析，但分析结果仅能做定性的判断。开发准确方便地定量鉴定食用油成份的试剂盒对于控制食品质量、确保食品品质，为我国食品的进出口贸易严格把关，保障我国人民的生命健康都具有重大意义。不同物种其遗传性质都会有不同的特异性，因此可通过检验其特异性基因来鉴别该物种。植物油生产过程中会残留少量油料的DNA，因此可以通过PCR (聚合酶链式反应)技术对不同油料DNA中的特异性基因进行扩增鉴别。棕榈油是ー种廉价食用油品，经常会在混合食用油中掺加以降低成本，为了获取更高利润，一些生产企业常会在高价食用油中添加棕榈油，但故意不做注明或标低其掺入比例，损害消费者利益，因此找到可以快速准确的鉴定食用油中棕榈油成分的方法是极为必要的。虽然现有技术已经作了很多研究，但是运用荧光定量PCR技术对食用油中掺入的棕榈油成分进行定量鉴别，建立ー种快速准确地定量鉴别检测体系，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是使用荧光定量PCR手段来对食用油中掺入棕桐油成分做快速准确的定量鉴别检測。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为ー种定量检测食用油中棕榈油成分检测试剂盒，其特征在于含有可以检测到掺入的棕榈油的检测试剂，所述检测试剂含有针对棕桐油的特异性引物和TaqMan探针，其序列为F 5/ -AGGGCAATTCCTAATGTATTGGAC-3’R 5/ -CGCAGTTAGAGCCGCATTT-3，
P 5/ -CGAGGAAGTCGTTGAGGTGGCAGC-3'；进ー步来说，所述检测试剂的特征是检测体系总体积为20ul，其中包含2ul 10XPremix (Takara), O. 2ull0 μ mol/L TaqMan探针,0. 4ull0 μ mol/L上、下游特异性引物，DNA模板2 4ul，用ddH20将总体积补至20ul。ー种定量检测食用油中棕榈油成分的检测方法，其特征是包括以下步骤(I)提取待检食用油样品DNA ；(2)以所提取的DNA作为模板，使用如上任一所述的试剂盒进行荧光定量PCR扩增检测； (3)參照荧光定量PCR标准曲线比对分析确定棕桐油成分所占比例。进ー步来说，所述步骤(2)中检测体系的反应条件为50°C /2min,95°C /3min,95で/158，60で/111^11，其中95で15s至60°C/lmin之间进行50个循环，在每个循环的60°C退火并延伸阶段收集荧光信号。进ー步来说，所述步骤(I)包括以下操作步骤在2mL离心管中加入ImL食用油及400 μ LTE缓冲液，颠倒混匀5min，室温下离心1300rpm，3min，去除上层油脂层；再次向同一支管中加入ImL食用油，离心后去除上层油脂层，反复20次。取水相加入400 μ L CTAB提取液和2μ L Rnase酶溶液漩涡振荡Is 3s，置于65°C水浴中30min，加入等体积24 :1三氯甲烷/异戊醇，轻缓颠倒数次后室温静置5min ；1300rpm,5min ;转移上清于新离心管中并加入I 2 μ g担体，加入O. 6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后于-20°c静置过夜；13000rpm室温离心lOmin，弃上清溶液，用70%こ醇洗涤沉淀两次，干燥，加入10 μ LTE缓冲液溶解沉淀，4°C保存以备后续荧光定量PCR检测时使用。与现有技术相比，本发明的优点在干建立了ー种快速、准确地鉴别食用油中掺入棕榈油的荧光定量PCR检测方法，能够准确地鉴别出食用油中棕榈油成分，同时也能定量的鉴别出其掺入比例。本研究方法与传统的食用油掺假鉴别方法相比更直观地提供可靠地数字依据。这为质量监瞀检测部门、进出口检验检疫部门以及卫生部门等提供有效监控食用植物油中假冒伪劣产品提供科学的方法依据，为有效打击不法商家的违法犯罪行为提供技术支持，为保障人民的消费权益以及生命健康提供有力的手段。
图I掺入花生油中棕榈油比例为1% 40%的荧光定量检测结果图(A :棕榈阳性对照；B :40%棕榈花生油；C :20%棕榈花生油；D :10%棕榈花生油；E :5%棕榈花生油；F 1%棕榈花生油；其余为阴性对照和空白対照)；图2掺入花生油中棕榈油比例为I % 40%的荧光定量标准曲线。
具体实施例方式现在以检测食用棕榈花生油中棕榈油成分比例为例来进ー步说明，具体步骤如下I.待检食用花生油DNA提取提取方法參照中华人民共和国进出口行业标准SN/T1203-2003《食用油脂中转基因植物成分定性PCR检测方法》:在2mL离心管中加入ImL食用花生油及400 μ LTE缓冲液，颠倒混勻5min,室温下离心1300rpm, 3min,去除上层油脂层；再次向同一支管中加入ImL食用花生油，离心，去除上层油脂层，反复20次。取水相加入400 μ L CTAB提取液和2μ LRnase酶溶液漩涡振荡Is 3s，置于65°C水浴中30min，加入等体积24 :1三氯甲烷/异戍醇，轻缓颠倒数次后室温静置5min ；1300rpm, 5min ；;转移上清于新离心管中并加入I
2μ g担体，并加入O. 6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后于_20°C静置过夜；13000rpm室温离心lOmin，弃上清溶液，用70%こ醇洗涤沉淀两次，干燥，加入10 μ LTE缓冲液溶解沉淀，4°C保存以备后续荧光定量PCR检测时使用。2.设定荧光定量PCR标准曲线通过对已知不同掺入比例的棕榈花生油进行荧光定量PCR扩增，获得不同的Ct值(图 1)，得到不同掺入比例棕榈油的花生油样品标准曲线的回归方程y= —·3. 863411gx+32. 346，R2=O. 994，其中y为循环域值Ct, x为棕榈油的掺入比例(图2)。3.待检花生油DNA的荧光定量PCR检测将步骤I中提取好的DNA按以下体系及反应条件进行扩增检测体系总体积为20ul,其中包含 2ul 10XPremix(Takara),O. 2ull0 μ mol/LTaqMan 探针，0. 4ull0ymol/L 上、下游特异性引物，4ul DNA, 13ul ddH20。反应条件为50°C/2min，95°C /3min，95°C /15s,60°C /lmin，其中 95°C /15s 至60°C /lmin之间进行50个循环，在每个循环的60°C退火并延伸阶段收集荧光信号。检测得到Ct值y为34，代入标准曲线回归方程y= — 3. 86341 lgx+32. 346获得x为O. 30，即得出用于检测的棕榈花生油中，所含棕榈油比例为30%。
权利要求
1.一种定量检测食用油中棕榈油成分的检测试剂盒，其特征在于含有棕榈油的检测试剂，所述检测试剂含有针对棕榈油的特异性引物和TaqMan探针，其序列为F : 5' -AGGGCAATTCCTAATGTATTGGAC-3，R :5' -CGCAGTTAGAGCCGCATTT-3，P :5' -CGAGGAAGTCGTTGAGGTGGCAGC-3'；
2.根据权利要求I所述的一种定量检测食用油中棕榈油成分的检测试剂盒，所述检测试剂的特征是检测体系总体积为20ul,其中包含2ul 10XPremix (Takara) ,0. 2ull0 u mol/LTaqMan探针，0. 4ull0 u mol/L上、下游特异性引物，DNA模板2 3ul，用ddH20将总体积补至20ul。
3.一种定量检测食用油中棕榈油成分的检测方法，其特征是包括以下步骤 (1)提取待检食用油样品DNA； (2)以所提取的DNA作为模板，使用如权利要求1、2任一所述的试剂盒进行荧光定量PCR扩增检测； (3)参照荧光定量PCR标准曲线比对分析确定棕榈油成分所占比例。
4.根据权利要求3所述的一种定量检测食用油中棕榈油成分的检测方法，其特征是所述步骤(2)中检测体系的反应条件为50°C /2min，95°C /3min，95°C /15s，60°C /lmin，其中95°C 15s至60°C /lmin之间进行50个循环，在每个循环的60°C退火并延伸阶段收集荧光信号。
5.根据权利要求3所述的一种定量检测食用油中棕榈油成分的检测方法，其特征是所述步骤(I)包括以下操作步骤在2mL离心管中加入ImL食用油及400ii LTE缓冲液,颠倒混匀5min，室温下离心1300rpm，3min，去除上层油脂层；再次向同一支管中加入ImL食用油，离心后去除上层油脂层，反复20次。取水相加入400 u L CTAB提取液和2 u LRnase酶溶液漩涡振荡Is 3s，置于65°C水浴中30min，加入等体积24 1三氯甲烷/异戊醇，轻缓颠倒数次后室温静置5min ；1300rpm, 5min ;转移上清于新离心管中并加入I 2 y g担体,加入.0.6倍体积预冷的异丙醇,颠倒混勻后于-20°C静置过夜；13000rpm室温离心IOmin,弃上清溶液，用70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥，加入10 u LTE缓冲液溶解沉淀，4°C保存以备后续荧光定量PCR检测时使用。
全文摘要
一种定量检测食用油中棕榈油成分检测试剂盒，其特征在于含有可以检测到掺入的棕榈油的检测试剂，所述检测试剂含有针对棕榈油的特异性引物和TaqMan探针。建立了一种快速、准确地鉴别食用油中掺入棕榈油的荧光定量PCR检测方法，能够准确地鉴别出食用油中棕榈油成分，同时也能定量的鉴别出其掺入比例。本研究方法与传统的食用油掺假鉴别方法相比更直观地提供可靠地数字依据。
文档编号C12Q1/68GK102808023SQ20121026498
公开日2012年12月5日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者梁德沛, 王力清, 周慧, 梁宇斌, 朱文亮, 佘之蕴, 刘辉 申请人:广东产品质量监督检验研究院