专利名称：一种纤维素酶在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维素酶蛋白的应用，尤其涉及一种纤维素酶蛋白在大肠杆菌中可溶性表达并分泌表达重组蛋白的应用。
背景技术：
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。因此，蛋白类分子是现代生物技术和生物制药产业发展的基石。蛋白质一直是生物研究的一个重要方面，获得大量纯化的蛋白质样品是蛋白质理化性质与功能研究、生物制药和酶制剂产业发展的基础。为了获得大量的重组蛋白，人们发展了多种的蛋白表达系统，而其中大肠杆菌表 达系统因其操作简单、遗传背景清楚、技术成熟、能够高效的表达各种异源蛋白等特点被广泛应用于研究和生产当中。但是，首先大肠杆菌表达的蛋白大都存在于细胞内，蛋白纯化困难；同时，大肠杆菌缺少蛋白的翻译后修饰系统，常常不能将翻译出的多肽链正确折叠修饰形成天然构象的蛋白质，而是形成不可溶的无功能的包涵体。包涵体中的多肽链折叠错误，必须通过复杂的变性复性过程才能获得有功能的蛋白，而复杂蛋白的复性过程的成功率非常低，导致蛋白的回收率非常低。以上这些方面都严重影响了大肠杆菌在重组蛋白生产方面的应用。为了克服大肠杆菌在蛋白表达方面的瓶颈，人们开发了多种促使外源蛋白在大肠杆菌中高效、可溶性及分泌表达的方法。其中，形成融合蛋白的方法在可溶性表达和分泌表达方面被广泛的利用，并具有良好的效果。现在普遍使用的融合伴侣蛋白如葡萄球菌A蛋白(SPA)、硫氧还原蛋白、谷胱甘肽转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或是周质蛋白TIoAIII等在融合后可提高蛋白的溶解性；0mpA、OmpF> OsmY或是YebF等蛋白融合后促进蛋白的分泌。但是这些融合伴侣蛋白的使用不具有普遍性、同时受到稳定性较差和效率不能达到生产的要求等因素的困扰。实验证实，选择一种合适的融合蛋白对于提高蛋白的溶解性和分泌性是至关重要，且融合伴侣蛋白在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值，因此寻找更为高效的、具有广泛适用性的融合伴侣蛋白成为目前研究的热点。本发明所述的纤维素酶蛋白为一种芽孢杆菌(Bacillus sp. Z_16)来源的纤维素酶(Cellulase)，其具有较高的水解纤维素的活性，目前主要应用于洗涤、纺织、造纸和环保等方面。我们发现这种蛋白可以在大肠杆菌中高效可溶、分泌表达。检索表明其在大肠杆菌中可溶及分泌表达的性质，以及其作为融和蛋白在大肠杆菌中进行重组蛋白的可溶及分泌表达的应用在国内外还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纤维素酶的蛋白序列，利用此蛋白序列作为融合蛋白，在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用。其中所述纤维素酶蛋白在大肠杆菌中能高效表达重组纤维素酶蛋白，并能以融合蛋白形式促进其它蛋白的分泌。本发明所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO :I所不的氣基酸序列，或是与SEQ ID N0:1所不氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。进一步的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。优选的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO :3所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。最优选的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，或是与所述氨基酸序列之一所示的氨基酸序列具有至少70%同源性的多肽序列。本发明所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的方法为将编码所述纤维素酶蛋白的核苷酸序列与编码所需表达蛋白的核苷酸序列连接组成融和基因后克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达。上述方法中，可以在本发明所述伴侣蛋白的末端添加纯化标签，以方便可溶性表达的融合蛋白的纯化。上述方法中，可以在本发明所述伴侣蛋白与所需表达蛋白之间添加水解酶位点。水解酶优选肠激酶、内含肽、凝血酶、各种蛋白酶等，以方便表达蛋白的纯化。上述方法中，融合蛋白可以使用层析柱进行分离纯化，在洗脱前使用相应的水解酶进行处理，以分离纯化目的蛋白。上述方法中，所述重组蛋白主要是蛋白酶类，特别是麦芽糖结合蛋白(MBP)、胰高血糖素样肽(GLP-I)或酵母糖酰胺酶(Pnglp)。本发明提供的纤维素酶蛋白或多肽序列可以在大肠杆菌中进行可溶性及分泌表达融合蛋白，同时本发明还提供了优选的蛋白分离纯化方法，为利用大肠杆菌制备蛋白质/多肽类药物、各种酶类、诊断抗原、抗体以及疫苗等提供了基础。在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值。
图I.纤维素酶(Cel)大肠杆菌高效表达载体的构建图。图2.为Cel在大肠杆菌中高效表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :低分子量蛋白标准O :携带空质粒载体的对照菌体其他条带为不同诱导时间的工程菌菌体。图3.为Cel在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :低分子量蛋白标准O :携带空质粒载体菌株发酵上清液其他条带为不同诱导时间的工程菌发酵液。
图4. Cel-⑶与Pnglp融和蛋白在大肠杆菌中高效可溶表达的SDS-PAGE检测结
果O图中M :低分子量蛋白标准I和2 :均为菌体破碎液中的可溶性Cel-⑶-Pnglp样品。图5.融和蛋白中纯化的Pnglp的脱糖基化性质测定。图中底物为变性的RNase BI :对照2 :Cel-CD_Pnglp 融和蛋白3 :纯化自融和蛋白的Pnglp蛋白4 :纯化包涵体的的Pnglp融合蛋白。图6. Cel-⑶与MBP融和蛋白在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :低分子量蛋白标准I :携带空质粒载体的对照菌体
2，3 :均为Cel-⑶-MBP融和蛋白诱导表达的菌体4 :携带空质粒载体的对照菌体发酵液5,6 :均为Cel-⑶-MBP融和蛋白诱导表达的发酵液上清。图7. Cel-⑶与GLP-I融和蛋白在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :低分子量蛋白标准I :携带空质粒载体的对照菌体发酵液2 :均为Cel-⑶-GLP-I融和蛋白诱导表达的发酵液上清。图8.含有所述引导肽序列的表达载体的构建图。图9. CBD在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :核酸分子标准I :引导肽I与CBD融合蛋白发酵结果2 :引导肽2与CBD融合蛋白发酵结果3 :引导肽3与CBD融合蛋白发酵结果
4 :引导肽4与CBD融合蛋白发酵结果。图10. PhoA在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。图中M :核酸分子标准I :引导肽I与PhoA融合蛋白发酵结果2 :引导肽2与PhoA融合蛋白发酵结果3 :引导肽3与PhoA融合蛋白发酵结果4 :引导肽4与PhoA融合蛋白发酵结果。
具体实施例方式下面结合附图，以较佳实施方式对本发明详细描述，但本所述内容不限制本发明。下列实施例中未标明具体条件的试验方法，基本上都按照分子克隆实验室手册(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件,或是按照相关试剂或是试剂盒制造商所建议的条件。
实施例I :纤维素酶在大肠杆菌中高效表达载体的构建I.菌株和质粒大肠杆菌DH5 α (E. coli DH5 a LacZ ΔΜ15 hsdR recA)大肠杆菌BL21 (DE3) (E. coli BL21 (DE3))大肠杆菌BL21 (DE3) /pLysS (E. coli BL21 (DE3) /pLys)质粒pET28a以上菌株和质粒均购自Novagen公司。2.分子克隆用酶和试剂限制性内切酶NcoI、BamHI ；Pfu DNA聚合酶；T4连接酶；蛋白分子量标准均购自MBI-Fermentas0Agarose Gel DNA Purification Kit, DNA Fragment Purification Kit 购自OMEGA Ltd.。TIANprep Mini Plasmid Kit 购自 TIANGEN。核酸分子量标准IKb Marker购自BioLab。3.方法以Bacillus sp. Z-16基因组DNA为模板，利用引物Cel-F/Cel-R扩增编码Cellulase (缩写为Cel)的基因序列，Cel基因的理论长度为2475bp。在Cel-Fl/Cel-Rl的两端分别带有Ncol/Xhol酶切位点，引物由北京华大基因公司合成Cel-Fl :5’ -TTTTCCATGGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3’ (酶切位点 NcoI)Cel-Rl 5 -TTTTCTCGAGTTTTTTCTTAGCCTCATTTTTG-3> (酶切位点 XhoI)以Cel-Fl和Cel-Rl为引物，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增Cel核苷酸序列。DNA 聚合酶为 TransEco FastPfu DNA Polymerase。Bacillus sp. Z_16 纤维素酶 Cel基因的PCR扩增体系及条件见表I. I表I. I纤维素酶基因的PCR扩增体系及条件
权利要求
1.一种纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO :1所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID NO :2所不的氣基酸序列，或是与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID NO :3所不的氣基酸序列，或是与SEQ ID NO 3所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
4.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列，或是与所述氨基酸序列之一所示的氨基酸序列具有至少70%同源性的多肽序列。
5.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的方法为将编码所述纤维素酶蛋白的核苷酸序列与编码所需表达蛋白的核苷酸序列连接组成融和基因后克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达。
6.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述重组蛋白是抗菌肽或酶类。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述重组蛋白是麦芽糖结合蛋白(MBP)、胰高血糖素样肽(GLP-I)或酵母糖酰胺酶(Pnglp)。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素酶蛋白在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的应用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO1～7所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO1～7所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列，所述重组蛋白是抗菌肽或酶类。本发明为利用大肠杆菌制备蛋白质/多肽类药物、各种酶类、诊断抗原、抗体以及疫苗等提供了基础。在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值。
文档编号C12N15/70GK102776216SQ20121026438
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者王圣钧, 祁庆生, 高冬芳 申请人:山东大学