专利名称：基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究的制作方法
技术领域：
本发明属于微流控芯片系统领域，具体涉及一种基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究。
背景技术：
微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术已经在包括生物学、医学、化学、材料学等多个领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、传热传质快、通量高可以集成等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。随着近二十年的不断发展，基于微流控芯片系统的细胞研究已有很大突破，相关细胞操作，如细胞的培养、分选、鉴定等已基本都可在芯片上实现。以此为基础更进一步的细胞学研究，特别是基于微流控芯片系统的细胞仿生微环境模拟等研究日益成为关注的焦点，在微流控芯片系统·上模拟甚至仿生细胞微环境用于研究细胞的相关行为，其关键点就是对细胞微环境进行精确模拟，这同时也是研究细胞与微环境相互作用的主要内容。模拟细胞微环境，特别是模拟与细胞生物物理因素有关的诸如流体剪切力、牵张力、基质物理性质、纳米表面等微环境依靠现有技术大多存在仪器设备复杂庞大，操作繁琐，对微环境模拟简单，不能实现对细胞的实时观测等问题，而随着微流控芯片研究的不断深入，微流控芯片系统或可成为一种用以仿生模拟细胞微环境的新型平台技术，并为同细胞微环境研究相关的组织修复、再造移植及生物仿生等方面提供技术与理论的支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，该微流控芯片系统将细胞的接种、长期培养、细胞受流体剪切力刺激、细胞染色及分析检测过程集成在一块功能化芯片上完成，实现了在微流控芯片平台上体内极低流体剪切力的模拟及细胞行为分析。细胞及试剂消耗量低，操作简便，易于检测。本发明以外部精确流体注射泵为动力源，以微流控芯片软刻蚀技术为基础，利用流体阻力原理设计并制造微流体通道阻力网络，致使微流控芯片细胞培养微室中的细胞可感受到不同大小的流体剪切力，进而研究细胞行为变化，该微流控芯片系统将细胞的接种、长期培养、细胞受流体剪切力刺激、细胞染色及分析检测过程集成在一块功能化芯片上完成，实现了在微流控芯片平台上体内极低流体剪切力的模拟及细胞行为分析。细胞及试剂消耗量低，操作简便，易于检测。本发明提供了一种微流控芯片系统，该系统由两个基本单元构成第一个基本单元为模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片，第二个基本单元为模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片外围设备。本发明提供的微流控芯片系统，所述的模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片是采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建的双层微流控芯片。本发明提供的微流控芯片系统，所述的微流控芯片分为两部分第一部分为微通道流体阻力网络，包括一系列根据流体阻力原理设计的不同粗细、长度的微通道；第二部分为多个细胞培养微室，具体结构如图I所示，细胞培养微室中的细胞将感受流体阻力网络形成的不同大小的极低流体剪切力，进而形成细胞响应并被检测。本发明提供的微流控芯片系统，所述的微通道流体阻力网络中的微通道和细胞培养微室的尺寸为高度为10微米厘米，宽度为30微米厘米，横截面样式可为矩形、正方形、圆形、半圆形。本发明提供的微流控芯片系统，所述的微通道和细胞培养微室的数目各为I个 1000个。本发明提供的微流控芯片系统，所述细胞培养微室用于细胞培养可进行表面修饰(I)对于在细胞培养微室内生存状态良好的细胞可不进行表面修饰处理，直接接·种细胞；(2)对于细胞培养微室内不易贴附或贴附后状态不佳的细胞可对通道内表面进行涂覆修饰，涂覆修饰的方法为直接在通道内注入用于增加细胞贴附的试剂，待一定时间过后再进行细胞接种，该种试剂是明胶、白明胶、胶原I型、胶原II型、胶原VI型、层粘蛋白之一种或多种；(3)对于模拟微环境中有特殊要求的，涂覆修饰过程试剂中可添加细胞生长因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)之一种或多种。本发明提供的微流控芯片系统，所述的微流控芯片外围设备是是模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片实现各功能的外部支持及细胞行为分析的检测装置，主要包括精密注射泵、医用注射器、医用输液器、聚苯乙烯管及荧光显微镜。本发明提供的微流控芯片系统，所述的精密注射泵可实现对流体的流速方向的精确控制，并可通过外围管路引入微流控芯片通道内，进而产生流体剪切力刺激。本发明还提供了基于所述的微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，以微流控芯片软刻蚀技术为基础，以外部精确流体注射泵为流体动力源，精确控制流体流量，利用流体阻力原理设计并制造微流体通道阻力网络，致使流经细胞培养微室中的流体产生一定大小的流体剪切力，细胞培养微室中的细胞感受到此流体剪切力，进而发生行为变化，经由细胞染色及分析，实现了在微流控芯片平台上流体剪切力的构建及细胞行为分析。本发明提供的基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，该微流控芯片系统可用于模拟流体剪切力大小范围为I. 0X10_9dyne/CnTldyne/Cm2的流体剪切力。本发明提供的模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控系统，能够实现间充质干细胞的长期贴附培养，利用模拟的体内极低流体剪切力可促使间充质干细胞成骨分化及运动相关蛋白的表达，其结果如图2、3所示。在该系统上对间充质干细胞进行成骨分化机制研究，发现该种极低流体剪切力可通过干预细胞的骨架蛋白进而促进其成骨分化。如图4分别所示。本发明提供的模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控系统，其间充质干细胞的相关检测方法为(I)成骨分化检测方法碱性磷酸酯酶ALP染色，骨桥蛋白OPN染色。(2)细胞骨架蛋白检测方法细胞骨架纤维蛋白F-actin染色。本发明提供的用于模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控系统，操作简便，试剂及细胞消耗量低，易于对细胞进行观察检测，是一种用于仿生模拟细胞微环境的新型平台技术。
图I模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片结构图，其中I为微通道流体阻力网络，2为细胞培养微室；
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图2间充质干细胞受极低流体剪切力刺激下成骨分化结果图；图3间充质干细胞受极低流体剪切力刺激下运动行为实时照片；图4间充质干细胞通过ROCK途径感受极低流体剪切力刺激的机制示意图；图5骨祖细胞受极低流体剪切力刺激下的细胞形态；图6软骨细胞受极低流体剪切力刺激下的细胞形态。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。制备模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片的材料为PDMS聚合物，等离子体不可逆封接。制备后的芯片通道加水高压灭菌，再置于无菌工作台内晾干。以小鼠胚胎间充质干细胞为例，芯片液路通道无需涂敷，依次用75%乙醇、无菌二次水、PBS、含胎牛血清15%的a -MEM培养基润洗并保证通道内无气泡残留。小鼠胚胎间充质干细胞在无菌一次性培养瓶中传代培养，实验时用胰酶消化，调节合适密度从细胞加样口用移液枪注射入细胞培养微室内，待24小时细胞完全贴壁后替换新鲜培养剂。若进行化学诱导剂同力学刺激共同作用的实验，则24小时之后替换诱导分化培养剂，成骨采用LG-DMEM+10%FBS+0. I μ M地塞米松+50 μ g/ml抗坏血酸+IOOmM β -甘油磷酸钠。调整精确注射泵的流量，使达到极低流体剪切力的范围，方式为持续灌流，灌流24小时之后可考察其运动行为，灌流7天之后可考察成骨碱性磷酸酶ALP的分泌，灌流14天之后可考察其骨桥蛋白OPN的情况。染色步骤为用PBS替换芯片通道内的培养基，并洗涤3次，用多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS冲洗3次。成骨碱性磷酸酯酶ALP染色为细胞固定之后用PBS冲洗，换用Tris缓冲液冲洗，在通道内加入现配的ALP染色液，15分钟之后用Tris冲洗3次拍照，计算碱性磷酸酯酶(蓝色)的光强度用以表征成骨分化的强弱。空白组为不施加力学刺激的情况。其他染色为荧光免疫方法染色，使用对应抗体即可。实施例I利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图I所示，通道尺寸深度为50 μ m，宽度为50 μ m到Imm不等，共可产生4个不同大小的流体剪切力，在注射泵流速为9 μ L/h的情况下，流体剪切力理论计算后分别为7. 7X 10_3，9. 9X 10_4，I. 4X 10_4and2. 9X10_5dyne/Cm2。芯片接种小鼠胚胎间充质干细胞，接种密度I X IO5个/ML，24小时细胞贴壁之后换用含胎牛血清15%的a -MEM培养基，施加流体剪切力，7天之后成骨ALP染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图3所示,在不同大小的流体剪切力作用下间充质干细胞的成骨分化行为有所差别，可以看出来的是7. 7X10-3dyne/cm2的流体剪切力作用下成骨最强，且14天之后OPN表达为阳性。实施例2利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图I所示，通道尺寸深度为50 μ m，宽度为50 μ m到Imm不等，共可产生4个不同大小的流体剪切力，在注射泵流速为9 μ L/h的情况下，流体剪切力理论计算后分别为7. 7X 10_3，9. 9X 10_4，I. 4X 10_4and2. 9X10_5dyne/Cm2。芯片接种小鼠胚胎间充质干细胞，接种密度I X IO5个/ML，24小时细胞贴壁之后换用LG-DMEM+10%FBS+0. I μ M地塞米松+50 μ g/ml抗坏血酸+IOOmM β -甘油磷酸钠成骨诱导分化培养基，施加流体剪切力，7天之后成骨ALP染色，14天之后成骨OPN染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。在不同大小的流体剪切力作用下间充质干细胞的成骨分化行为有所差别，可以看出来的是7. 7X 10_3dyne/Cm2的流体剪切力作用下成骨ALP和OPN表达最强。·实施例3骨祖细胞利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，其流体剪切力范围为7. 7 X ΙΟ-3, 9. 9X 10_4，I. 4X l(T4and2. 9X l(T5dyne/cm2。芯片接种骨祖细胞系细胞 3T3-E1，接种密度I X IO5个/ML，24小时细胞贴壁之后，每天换液，并施加流体剪切力刺激，力学刺激7天之后检测成骨特征性标志物ALP，发现流体剪切力可促进骨祖细胞向成骨方向分化。实施例4软骨细胞利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，通道尺寸深度为100 μ m，宽度为ΙΟΟμ 到2mm不等，其流体剪切力范围为O. 5,0. 1,0. 02,0. 001 dyne/cm2 芯片接种大鼠软骨细胞，接种密度I X IO5个/ML，24小时细胞贴壁之后，每天换液，并施加流体剪切力刺激，力学刺激3天之后可检测软骨特征性标志物一型胶原、二型胶原、蛋白多糖，发现流体剪切力可维持软骨细胞的表型。
权利要求
1.一种微流控芯片系统，其特征在于该系统由两个基本单元构成第一个基本单元为模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片，第二个基本单元为模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片外围设备。
2.按照权利要求I所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片是采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建的双层微流控-H-* I I心/T O
3.按照权利要求I或2所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的微流控芯片分为两部分第一部分为微通道流体阻力网络，由微通道组成；第二部分为细胞培养微室。
4.按照权利要求3所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的微通道流体阻力网络中的微通道和细胞培养微室的尺寸为高度为10微米 I厘米，宽度为30微米 I厘米，横截面样式可为矩形、正方形、圆形、半圆形。
5.按照权利要求3所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的微通道和细胞培养微室的数目各为I个 1000个。
6.按照权利要求I所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的微流控芯片外围设备是是模拟体内极低流体剪切力的细胞行为研究微流控芯片实现各功能的外部支持及细胞行为分析的检测装置，主要包括精密注射泵、医用注射器、医用输液器、聚苯乙烯管和荧光显微镜。
7.按照权利要求6所述的微流控芯片系统，其特征在于所述的精密注射泵可实现对流体的流速方向的精确控制，并可通过外围管路引入微流控芯片通道内，进而产生流体剪切力刺激。
8.基于权利要求I所述的微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，其特征在于以微流控芯片软刻蚀技术为基础，以外部精确流体注射泵为流体动力源，精确控制流体流量，利用流体阻力原理设计并制造微流体通道阻力网络，致使流经细胞培养微室中的流体产生一定大小的流体剪切力，细胞培养微室中的细胞感受到此流体剪切力，进而发生行为变化，经由细胞染色及分析，实现了在微流控芯片平台上流体剪切力的构建及细胞行为分析。
9.按照权利要求8所述的基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，其特征在于所述的流体剪切力大小范围为I. OX 10_9dyne/cm2 ldyne/cm2。
全文摘要
一种基于微流控芯片系统的模拟体内流体剪切力细胞行为研究，以外部精确流体注射泵为动力源，以微流控芯片软刻蚀技术为基础，利用流体阻力原理设计并制造微流体通道阻力网络，致使微流控芯片细胞培养微室中的细胞可感受到不同大小的流体剪切力，进而研究细胞行为变化，该微流控芯片系统将细胞的接种、长期培养、细胞受流体剪切力刺激、细胞染色及分析检测过程集成在一块功能化芯片上完成，实现了在微流控芯片平台上体内极低流体剪切力的模拟及细胞行为分析。
文档编号C12M1/34GK102787071SQ20121026472
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者秦建华, 高兴华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所