专利名称：一种扩增未知序列的半随机pcr技术及其引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种扩增未知序列的半随机PCR技术及其引物和试剂盒。
背景技术：
聚合酶链式反应技术(PCR)是分子生物学中的重要技术手段，但PCR技术中必须设计引物，这就需要知道目标基因的部分序列。到目前为止，绝大多数物种的基因组序列仍然未知，而且基因序列变异大，引物设计困难。人们设计出各种技术方案，检测未知序列。其中建库测序较准确，但操作繁杂，实验时间长，经费高；现有的随机引物PCR技术，虽然操作较简单，费用较低，但是因为PCR扩增程序中退火温度相对较低，所以扩增出的核酸目的序列特异性较差。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的随机引物PCR技术退火温度较低，扩增出的核酸目的序列特异性较差的缺陷，提供一种扩增未知序列的半随机PCR技术及其引物和试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列从5’端到3’端依次为12 30个固定碱基,3 8个全简并的碱基N和3 7个固定碱基，其中所述N为A或G或C或T。本发明所述寡核苷酸为本领域常规的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸较佳地包括多聚脱氧核糖核苷酸、多聚核糖核苷酸及其他类型的多核苷酸中的一种或几种；如嘌呤或嘧啶碱基经过修饰后的嘧啶或嘌呤碱基。“寡核苷酸”和“核酸”之间没有长度上的区别，可以互换使用。本发明所述的寡核苷酸来源为本领域常规来源，所述寡核苷酸的来源较佳地包括人工合成寡核苷酸或从天然存在的基因组中提取获得所述的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸的人工合成方法较佳地包括磷酸三酯法、磷酸二酯法、二乙基磷酸酰胺法和固相载体法中的一种或几种。其中所述寡核苷酸的序列优选地为如序列表中SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。其中所述寡核苷酸中的N代表的核苷酸较佳地包括长度为3 8个全简并碱基的核苷酸，其中所述全简并核苷酸优选地为由6个全简并碱基组成的核苷酸。其中所述的全简并碱基为本领域常规的核苷酸碱基，所述全简并核苷酸碱基较佳地包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是一种PCR步移扩增基因试剂盒，其中所述PCR步移扩增基因试剂盒包括如上所述的寡核苷酸、dNTP、MgCl2、10XPCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。其中所述PCR步移扩增基因试剂盒较佳地包括本领域常规PCR试剂。所述PCR试剂较佳地包括dNTP、MgCl2溶液、PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是一种PCR步移扩增基因的方法，其中所述PCR步移扩增基因的方法以前述的寡核苷酸为引物，以目标DNA为模板，所述PCR步移扩增基因的方法的反应体系包括如前所述的寡核苷酸0. 2 3iimol/L，0. 2 Immol /T, dNTP, I. 5 3mmol/L 的 Mg2+, Taq DNA 聚合酶 0. 02 IU/ u L,模板核昔酸的添加量为20 IOOOng ;所述PCR扩增的反应程序包括(I) 92 95°C，变性 3 6 分钟；(2) 92 94°C，变性 30 45 秒；(3)52。〇 64。〇，退火30秒；(4) 72°C延伸2分钟，其中步骤(2) (4)重复30 45个循环；(5) 70 75°C延伸 120 300 秒；
·
(6)产物于4°C保存。本发明所述的PCR步移扩增基因的方法为本领域常规使用的核酸目的序列扩增方法。所述核酸目的序列的扩增方法较佳地指聚合酶链式反应(PCR)。所述聚合酶链式反应(PCR)是指体外酶促合成核酸特异目的片段的一种方法，该方法程序较佳地包括高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，从而使核酸目的片段得以迅速扩增。其中所述聚合酶链式反应体系为本领域常规的聚合酶链式反应(PCR)体系，所述PCR反应体系较佳地包括寡核苷酸(引物)、核酸聚合酶、dNTP、模板核苷酸和Mg2+。本发明所述PCR反应体系较佳地包括所述的寡核苷酸含量较佳地为0. 2 3 ii mol/L,优选地为0. 5 ii mol/L,所述dNTP的含量较佳地为0. 2 lmmol/L，含量优选地为0. 2mmol/L, Mg2+浓度较佳地为I. 5 3mmol/L，浓度优选地为I. 5mmol/L, Taq DNA聚合酶添加量较佳地为0. 02 IU/ u L，添加量优选地为0. 02U/ u L，模板核苷酸添加量较佳地为20 lOOOng，添加量优选地为50ng。其中所述聚合酶链式反应条件为本领域常规的PCR反应条件,所述PCR反应程序较佳地包括(I)变性温度较佳地为92 95°C，优选地为94°C，变性时间为较佳地为3 6min，优选地为5分钟；(2)变性温度较佳地为92 94°C，优选地为94°C，变性时间较佳地为30 45秒，优选地为30秒；(3)退火温度较佳地为52 60°C，优选地为56°C，退火时间较佳地为30秒；(4)延伸温度优选地为72°C，延伸时间优选地为2分钟，其中步骤(2) (4)循环次数较佳地为30 45，优选地为30个循环；(5)延伸温度较佳地为70 75°C，优选地为72°C，延伸时间较佳地为120 300秒，优选地为300秒；(6)产物于4°C保存。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下利用本发明提供的半随机PCR技术及其引物和试剂盒进行聚合酶链式反应，无需设计引物即可扩增目标基因序列，该方法通用性强，特别适合未知基因序列的扩增。本发明所述PCR反应程序简单，退火温度高于50°C，扩增序列特异性较强，来源于微生物、动物、植物等基因序列未知的样品均可使用该方法，因此该方法通用性强，具有十分广阔的应用前景。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I是XA菌株半随机引物PCR结果。I是PCR结果电泳图谱，M是DL2，000DNAmarker。图2是BX动物基因组半随机引物PCR结果。I是PCR结果电泳图谱，M是DL2, 000DNA marker0
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I随机引物鉴定微生物种类I. I模板制备从污染乳品中分离细菌使用3ml LB培养基，加入0. Iml的污染乳品，37°C培养48小时，筛选得到污染乳品中的未知细菌。提取细菌基因组。使用的试剂盒为TaKaRa minibest bacterial genomic dnaextraction kit ver. 2. 0 (Takara Biotechnology (Dalian) Co.，Ltd.),抽提从污染乳品中分离的细菌基因组DNA。所述细菌基因组DNA编号为XA。1.2PCR 扩增使用半随机引物API :5，_ggc gtt tat tea gaa g(n)6cgc c_3’做 PCR 扩增。PCR程序为(I) 94°C，变性时间 5min ；(2) 94°C，变性 30S ;(3) 52°C，退火 30S ;(4) 70°C，延伸30S ;步骤(2) (4)重复30个循环；(5)72。〇延伸51^11(6)产物于4°C保存。PCR反应体系体积为20iU，其中各组分终浓度为liimol/L半随机引物，0. 2mmol/L dNTP, I XPCR 缓冲液，I. 5mM 的 Mg2+，Taq DNA 聚合酶 0. 02U/ u L,模板 20ng。其中 TaqDNA 聚合酶的生产商是 TakaraBiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.，商品号为 DR001A。PCR产物电泳结果见图1，图中编号“I”为XA半随机引物PCR结果，“M”为DL2, 000DNA Marker,购自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。将泳道 I 中大于 500bp的所有目的条带回收纯化，克隆测序。挑选6个克隆子测序，所测序列在NCBI网站做BLAST，其结果都仅仅与枯草芽孢杆菌同源性大于99%，与其它细菌同源性低。由此鉴定XA为枯草芽孢杆菌。实施例2随机弓I物鉴定动物种类2. I模板制备
提取动物组织基因组DNA。所用试剂盒为DNA isolation reagent for meat andmeat products,购自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。所得的动物组织基因组编号为BX。2. 2PCR 扩增用半随机引物AP2 :5，-gtc ggc gtt tat tea gaa g(n)6acg cc_3，做 PCR 扩增。PCR程序为(I) 94°C,变性 5min ；(2) 94°C，变性 30S ;(3) 58°C，退火 30S ;
(4)72°C，延伸两分钟；步骤(2) (4)重复30个循环；(5)72。0延伸51^11(6)产物于4°C保存。PCR反应体系体积为20iU，其中各组分终浓度为liimol/L半随机引物，0. 2mmol/L (1见？，1\ 0 缓冲液，I. 5mM 的Mg2+，TaqDNA聚合酶 0. 02U/y L，模板DNA200ng，其中 TaqDNA 聚合酶的生产商为 Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.,商品号为 DR001A。PCR产物电泳结果见图2，图中编号“I”为动物基因组PCR结果，“M”为DL2，000DNAMarker,购自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。将泳道I中大于500bp的所有目的条带回收纯化并克隆测序。所测序列在NCBI网站做BLAST，其结果与牛基因同源性大于99%，与其它物种同源性低。由此鉴定BX为牛的组织。实施例3随机引物鉴定微生物种类3. I模板制备从污染乳品中分离细菌的方法为使用3ml LB培养基，加入0. Iml的污染乳品，37°C培养48小时，筛选得到污染乳品中的未知细菌。提取细菌基因组。使用的试剂盒为TaKaRa minibest bacterial genomic dnaextraction kit ver.2.0,购自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd ,抽提从污染乳品中分离的细菌基因组DNA。所述细菌基因组DNA编号为XC。3. 2PCR 扩增使用半随机引物APl :5，-ggcgtt tat tea gaa g(n)6cgc c_3，做 PCR 扩增。PCR程序为(I) 95°C，变性 6 分钟;(2) 94°C，变性 45 秒;(3) 64°C，退火 30 秒；(4) 72°C延伸2分钟，其中步骤(2) (4)重复45个循环；(5) 75°C延伸 180 秒;(6)产物于4°C保存。PCR反应体系体积为20iU，其中各组分终浓度为3iimol/L半随机引物，0. 2mmol/L (1见？，1\ 0 缓冲液，I. 5ml^9Mg2+，Taq DNA聚合酶 0. 02U/y L，模板DNAlOOOng。其中TaqDNA聚合酶的生产商是Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.，商品号为DROOIA。将泳道中大于500bp的所有目的条带回收纯化，克隆测序。挑选5个克隆子测序，所测序列在NCBI网站做BLAST，结果都仅仅与枯草芽孢杆菌同源性大于99%，与其它细菌同源性低。由此鉴定XC为枯草芽孢杆菌。实施例4随机引物鉴定动物种类4. I模板制备提取动物组织基因组DNA。所用试剂盒为DNA isolation reagent for meat andmeat products,购自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。所得的动物组织基因组编号为DX。4. 2PCR 扩增 用半随机引物AP2 :5，-gtc ggc gtt tat tea gaa g(n)6acg cc_3，做 PCR 扩增。PCR程序为(1)94 °C，变性 5 分钟;(2) 93°C，变性 40 秒;(3) 60°C，退火 30 秒；(4) 72°C延伸2分钟，其中步骤(2) (4)重复30 45个循环；(5) 72°C延伸 120 秒;(6)产物于4°C保存。PCR反应体系体积为20iU，其中各组分终浓度为0. 2 mol/L半随机引物，
0.2mmol/LdNTP, I X PCR 缓冲液，I. 5mM 的 Mg2+，TaqDNA 聚合酶 0. 02U/ u L,模板 DNA500ng，其中 TaqDNA 聚合酶的生产商为 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.,商品号为 DR001A。将泳道中大于500bp的所有目的条带回收纯化克隆测序。所测序列在NCBI网站做BLAST，结果与牛基因同源性大于99%，与其它物种同源性低。由此鉴定DX为牛的组织。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸序列从5’端到3’端依次为12 30个固定碱基，3 8个全简并的碱基N和3 7个固定碱基，其中所述N为A或G或C或T。
2.如权利要求I所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的序列如序列表中SEQID NO. I 或 SEQ ID NO. 2 所示。
3.—种PCR步移扩增基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR步移扩增基因的试剂盒包括如权利要求I所述的寡核苷酸。
4.如权利要求3所述的PCR步移扩增基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR步移扩增基因的试剂盒还包括dNTP，MgCl2,10XPCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
5.—种PCR步移扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR步移扩增基因的方法以权利要求I所述的寡核苷酸为引物，以目标DNA为模板，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系包括权利要求I所述的寡核昔酸O. 2 3 μ mol/L, O. 2 Immol /T, dNTP, I. 5 3mmol/L的Mg2+，Taq DNA聚合酶O. 02 IU/ μ L，模板核苷酸的添加量为20 IOOOng ;所述PCR扩增的反应程序包括 (1)92 95°C，变性3 6分钟； (2)92 94°C，变性30 45秒； (3)52 64°C，退火 30 秒； (4)72°C延伸2分钟，步骤(2) (4)重复30 45个循环； (5)70 75°C延伸 120 300 秒； (6)产物于4°C保存。
6.如权利要求5所述PCR步移扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR步移扩增基因的方法的反应体系包括0. 5 μ mol/L权利要求I所述的寡核苷酸，O. 2mmol/L dNTP, I. 5mmol/L Mg2+，O. 02U/ μ L Taq DNA 聚合酶和 20 500ng 模板。
7.如权利要求5所述PCR步移扩增基因的方法，其特征在于，所述所述PCR步移扩增基因的程序包括 (1)95°C变性5分钟； (2)94°C变性 30 秒； (3)56°C退火30 秒； (4)72°C延伸2分钟，步骤(2) (3)重复30个循环； (5)72°C，延伸300 秒； (6)产物于4°C保存。
全文摘要
本发明公开了一种扩增未知序列的半随机PCR技术及其引物和试剂盒。半随机引物序列从5’端到3’端依次为12～30个固定碱基，3～8个全简并的碱基N和3～7个固定碱基，其中所述N为A或G或C或T。半随机引物的序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。包含该引物的PCR反应程序优选地包括(1)95℃变性5分钟；(2)94℃变性30秒；(3)56℃退火30秒；(4)72℃延伸2分钟，步骤(2)～(3)重复30个循环；(5)72℃，延伸300秒；(6)产物于4℃保存。该半随机引物通用性强，特别适合未知基因序列的扩增，该PCR反应程序简单，扩增核酸目的序列特异性较强。
文档编号C12N15/11GK102757960SQ201210266240
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者任婧, 张红发 申请人:光明乳业股份有限公司