专利名称：PPAR α基因及用作为鹅脂肪沉积相关遗传标记的方法
技术领域：
本发明涉及鹅的分子生物学技术及育种领域，具体是涉及测定与腹脂重、腹脂率相关特征的遗传标记的存在，更具体地说，是测定PPARa基因中的多态性，即与腹脂重和腹脂率相关的鹅过氧化物酶体增值物激活受体(PPAR)基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,缩写为 SNP)的存在。
背景技术：
现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质不佳。
PPAR(Peroxisome Proliferators activated receptors)属于核激素受体超家族，它能够调控许多参与细胞内外脂类代谢的目的基因，还参与脂肪细胞分化。PPAR有三种亚型α、β、Y。PPARa的目标基因是一组参与脂类分解的基因，能调控肝脏过氧化物酶体氧化；PPARY参与脂肪细胞的分化及细胞内外脂类代谢相关目标基因的调控，影响脂肪酸在脂肪组织中贮存，对脂肪生成起作用，大部分PPARy的目标基因直接参与脂肪合成途径，包括脂蛋白脂酶(LPL)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、乙酰酰辅酶A合成酶和脂肪酸转运蛋白(FATP)。鸡PPAR α基因的cDNA长593bp、CDS (mRNA反转录产物PCR的产物)为1407bp。 孟和等对PPAR基因作为鸡脂肪性状候选基因的可能性做了研究，结果表明用7对引物对 AA肉鸡PPARa基因全编码区用PCR-SSCP方法进行扫描后发现引物4扩增片段上有一个 C-T的单碱基突变，从而鸡群出现AA、AB、BB三个基因型。BB基因型的腹脂重和腹脂率显著较高，从而推测PPARa基因可能是影响鸡脂肪代谢的主效基因或与主效基因连锁，可用于鸡脂肪性状的分子标记辅助选择。孟和等的研究结果表明PPAR α和PPAR Y的不同基因型在地方鸡、蛋鸡、肉鸡中的频率存在差异；PPARa三种基因型与腹脂、腹脂率间极显著相关，其中BB型腹脂和腹脂率最闻，AA型最低。PPARy的二种基因型间不存在此类相关。 用Northern杂交法可知PPARy基因在鸡的脂肪组织和肾脏中高量表达。推测PPARa与脂肪代谢、沉积密切相关。解相林等报道，PPAR基因单核苷酸多态与脂肪性状存在显著相关，李春雨等研究表明，鸡的PPARy基因SNPs在沉默突变的情况下仍然与腹脂重、腹脂率等存在显著关系，推测PPARy基因可作为鸡体脂肪性状的主效基因。
但是，目前有关鹅的DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究相对鸡来说还很少，且没有关于鹅PPAR α基因的研究报道。 发明内容
针对上述现有技术的不足，提供一种PPARa基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途；同时筛选与鹅脂肪性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在鹅标记辅助选择中的应用。
本发明实施例是这样实现的，一种PPARa基因，所述基因为与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因。
进一步，所述基因PPARa序列的第175碱基处有一个碱基突变C175-G175。
进一步，克隆PPARa基因所用引物的序列如下
正向引物5'-CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3'，
反向引物5'-CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'。
进一步，突变导致所编码的氨基酸发生改变，而且氨基酸高腹脂的为谷氨酸(E)， 低腹脂的为谷氨酰胺(Q)。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用PPARa基因作为鹅脂肪沉积相关遗传标记的方法，该包括如下步骤
(I)根据GenBank中鸡PPAR α基因的mRNA序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，再获得鹅基因组DNA ；
(2)以上述鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(3)鉴定该基因序列的第175碱基处是否存在多态性。
进一步，所述方法选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下
(I)选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅200只进行饲养试验；
(2)根据PPARa基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；
(3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。
本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出PPARa基因为鹅脂肪沉积的相关基因，继而从鹅PPARa基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定 PPARa基因为脂肪沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的鹅PPAR a 基因的SNP可作为鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出腹脂更少的鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1鹅相关基因SNP筛选
选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅配套系商品鹅200只进行饲养试验。对该些鹅进行高腹脂型和低腹脂型鉴定，并从高腹脂型和低腹脂型样本中分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鸡PPARa基因的mRNA序列，用Primer 5. O设计引物，覆盖该基因部分编码序列，引物序列为5 ' -CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3 '(正向)， 5' -CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'(反向)，由上海英韦创津公司合成。用上述引物分别对提取的鹅基因组DNA进行扩增。
PCR 10μ I 反应体系10 Xbuffer (含 Mg2+)ly 1，上、下引物(20ymol/L)各 O. 15 μ I, dNTPs(10ymol/L)0. 2μ I，Taq 酶 1U，DNA(IOOng) O. 7 μ I，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序94°C 5分钟预变性后30个PCR循环参数为95°C 30秒，57°C 30秒，72 0C 30秒，最后72 0C 7分钟。
取扩增产物5 μ 1，加入变性剂(95%甲硝铵)10μ 1，95°C变性10分钟，再冰浴5 分钟后，点样于15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(丙烯酰胺/N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺为 29 I)，电压保持在80 100V，常温下电泳约16 18小时，直至兰色溴酚蓝染料至凝胶最底端为止。凝胶用硝酸银染色，SSCP分析结果表现为鹅PPARa基因部分DNA片段有三种不同条带类型，说明该DNA片段存在SNP。三种不同条带类型分别定义为GG型和CC型， 杂合型定义为GC型。
取PCR扩增产物50 μ 1，产物纯化后送上海英韦创津公司测序，测序结果确证了 PCR产物是PPARa基因，PCR产物的长度为464bp，序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示。 将鹅PPARa基因片段序列与其它16个物种的GenBank中已登录的PPARα基因序列进行同源性比对，结果表明鹅PPARa基因片段序列与番鸭、家鸭、鼠等动物有95%以上同源性， 而与鸡、人、牛、羊等动物的有80%以上，进一步说明PPARa基因在进化过程中有较高的保守性。
将上述产物进行氨基酸序列分析，结果如下(见SEQ ID NO 2)
权利要求
1.一种PPARa基因，其特征在于，所述基因为与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因。
2.如权利要求1所述的PPARa基因，其特征在于所述基因PPARa序列的第175碱基处有一个碱基突变C175-G175。
3.如权利要求1所述的PPARa基因，其特征在于，克隆PPAR a基因所用引物的序列如下 正向引物5' -CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3'， 反向引物5' -CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'。
4.如权利要求2所述的PPARa基因，其特征在于，突变导致所编码的氨基酸发生改变，而且氨基酸高腹脂的为谷氨酸(E)，低腹脂的为谷氨酰胺(Q)。
5.一种用PPARa基因作为鹅脂肪沉积相关遗传标记的方法，其特征在于，该包括如下步骤 (1)根据GenBank中鸡PPARa基因的mRNA序列，用Primer 5. O设计引物，覆盖该基因部分编码序列，再获得鹅基因组DNA ； (2)以上述鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQID NO.1所示的核苷酸序列； (3)鉴定该基因序列的第175碱基处是否存在多态性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下 (1)选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅200只进行饲养试验； (2)根据PPARa基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序； (3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。
全文摘要
本发明公开了一种过氧化物酶体增值物激活受体PPARα基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途，测定出PPARα基因中与鹅腹脂重、腹脂率相关的遗传标记，并测定从鹅获得的核酸样品中PPARα基因中多态性的存在，该多态性导致所编码的氨基酸发生改变，并且与腹脂重、腹脂率存在相关。根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有PPARα基因的动物进行脂肪性状选育，筛选出降低鹅腹脂重、腹脂率的优势基因型，具有极其重大的应用价值和经济效益。
文档编号C12Q1/68GK103031307SQ20121030665
公开日2013年4月10日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者曲湘勇, 何俊, 蒋隽, 贺长青 申请人:湖南农业大学, 曲湘勇