专利名称：检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种同步检测分枝杆菌感染及鉴别结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的五重mPCR-DHPLC方法。
背景技术：
分枝杆菌属(Mycobacterium),除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外，统称为非结核分枝杆菌。据目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共200多种。结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)是人及哺乳动物的结核病原菌,包括结核分枝杆菌(又称人型结核分枝杆菌，Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis),牛分枝杆菌(牛型结核分枝杆菌，Mycobacterium bovis, M. bovis),卡介苗 BCG (Mycobacteriumbovis BCG, BCG),非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum, M. africanum)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti, M. microti)。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。临床上，各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性；因此，鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。由于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性，因此准确鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌,在结核分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病原，也可感染人。它是一种机会性细菌，在AIDS病人细菌感染合并症中占第一位；在抗酸菌中对化疗药物耐药性最强，并广泛存在于天然土壤和水中。副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)是引起牛、羊、羊5它等动物副结核病的病原。副结核病自1895年首次被报道后，现已广泛流行于世界各国。2002年韩国某地区调查研究显示162个奶牛场中存在副结核病流行；在我国该病分布广泛，感染率在近年有上升趋势，部分地区甚至达44. 8%，严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、隔离、淘汰病畜等方法。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳性肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86. 4%，牛结核分枝杆菌占2. 5%,非结核分枝杆菌占11. 1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4. 9%,由此可见,非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需I 2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法，大体上可分为3类第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附实验(ELISA)和补体结合实验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法，也是目前在进出境动物检疫、牛结核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因，常造成非特异性反应。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了结核、副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性 的关键。世界卫生组织于2006年10月发表报告指出，世界迫切需要投资研究更有效和费用更低的结核病诊断方法，尽早发现病情尽早治疗，以减少这种疾病对人类、特别是对发展中国家人口的危害。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列(分枝杆菌通用型检测引物)，一组鉴别多种致病分枝杆菌群(种)的核苷酸序列。本发明的又一目的在于，提供一种同步检测分枝杆菌及鉴别多种重要致病分枝杆菌群(种)的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其组成为检测分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对，其中一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；另一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示；鉴别副结核分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示；鉴别鸟分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 13和SEQ IDNo. 14所示。一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸包括核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示的检测分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 3所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 9所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的副结核分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 12所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 15所示的PCR扩增产物。一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR 缓冲液；检测分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. I所示；检测分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示；鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 4所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 5所示；鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 7所示；鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 8所示；鉴别副结核分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10所示；鉴别副结核分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10和SEQ IDNo. 11所示；鉴别鸟分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 13所示；鉴别鸟分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 14所示；dNTP ；MgCl2 ；Pfu快速高保真聚合酶；双蒸水； 阴性对照灭菌生理盐水；阳性对照携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 9,SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 15所示；所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体。一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法(I)采集样品并提取核酸本发明可检测细菌培养液、动物活体采集的样品如血液、奶液、痰液和粪便等，以及通过剖检采集的组织样品，如淋巴结等；采集到的样品通过蛋白酶K消化、高温裂解之后用氯仿抽提提取核酸。(2)在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号，放入PCR仪中扩增；其中，优选的PCR反应体系如下
权利要求
1.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其组成为 检测分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNo. I 和 SEQ ID No. 2 所示； 鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对，其中一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；另一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 所示； 鉴别副结核分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 10 和 SEQ ID No. 11 所示； 鉴别鸟分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No. 13和SEQ ID No. 14 所示。
2.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸的组成为 核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示的检测分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 3所示的PCR扩增产物； 核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 6,SEQID No. 9所示的PCR扩增产物； 核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的副结核分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 12所示的PCR扩增产物； 核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No. 15所示的PCR扩增产物。
3.—种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 PCR缓冲液； 检测分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. I所示； 检测分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示； 鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 4所示； 鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 5所示； 鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 7所示； 鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 8所示； 鉴别副结核分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10所示； 鉴别副结核分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10和SEQ IDNo. 11所示； 鉴别鸟分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 13所示； 鉴别鸟分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 14所示； dNTP ； MgCl2 ； Pfu快速高保真聚合酶； 双蒸水；阴性对照灭菌生理盐水； 阳性对照携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 12 和 SEQ ID No. 15 所示。
4.一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法 (I)采集样品并提取核酸； (2 )对提取的核酸进行PCR扩增，其中 PCR的反应体系为 序列如 SEQ ID No. I 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 2 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 4 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如 SEQ ID No. 5 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 7 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如SEQ ID吣.8所示的引物101111101/1，0.51^; 序列如 SEQ ID No. 10 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如 SEQ ID No. 11 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 13 所示的引物10iimol/L，0.5iiL; 序列如 SEQ ID No. 14 所示的引物10iimol/L，0. L ; PCR 缓冲液10X，3iiL ;MgSO425mmol/L,I. 8 u L ；dNTP 2mmol/L, 3 u L ；KOD-Plus lU/u L,0. 6u L ；模板5 ii L ;双蒸水11. 4 ii L ；总计30 u L ； PCR的反应条件为 第一步95°C 2分钟；第二步95°C 5秒，62°C 5秒，68°C 5秒，40个循环；第三步，72°C I分钟； (3)对扩增产物进行DHPLC检测；阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为分别携带有如序列表 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 12 和 SEQ ID No. 15 所示的序列的质粒DNA ； (4) 分析、判定结果样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰位置一致，且阴性对照无相应的洗脱峰，则样品为阳性。
全文摘要
本发明提供了一组用于检测分枝杆菌及鉴别致病分枝杆菌的五重mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，包括核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的五对引物，以及作为阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的PCR扩增产物。本发明还提供了一种利用上述核酸的试剂盒及检测方法，其特异性好，灵敏度高，操作简单，高通量，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。
文档编号C12N15/11GK102808031SQ20121030610
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者陈茹, 高小博, 马旭, 陆彩玲, 刘志玲, 马静云 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 国家人口计生委科学技术研究所