一种在幼虫期鉴别家蚕吐丝颜色的方法

专利名称：一种在幼虫期鉴别家蚕吐丝颜色的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鉴别家蚕吐丝颜色的方法，具体的是利用家蚕Cbp基因和Cbp-Iike基因转录的mRNA的特异序列，特异性鉴别家蚕吐丝颜色，同时区分吐全部黄色丝的家蚕与吐部分黄色丝的家蚕、纯合型吐黄色丝的家蚕与杂合型吐黄色丝的家蚕，以及鉴别吐黄色丝的色度与色牢度差异。
背景技术：
家蚕(Bombyx mori)也称桑蚕，是被产业化利用大量生产丝蛋白纤维的昆虫。蚕丝是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，也称茧丝。现代茧丝绸エ业主要利用家蚕白色茧丝，通过化学染色等生产エ艺生产有色丝绸产品，在染色及后整理加工过程中使用的染料和其它化学药物有相当一部分含有对人体有害甚至致癌的物质，印染废水则成为エ业污水的重要整治目标。 家蚕天然彩色茧是人类早已发现的资源，家蚕天然茧色主要有黄红茧系、黄绿茧系和白茧系3类。黄红茧系包括淡黄、金黄、肉色、红色、蒿色、锈色等多种茧色；黄绿茧系包括竹绿(淡緑)和緑色两种。家蚕天然彩色茧丝纤维吸湿导湿性能强、抑菌性能优，吸收紫外线与抗氧化等护肤能力好，具有色彩天然、色泽雅致等突出性能，生产的纤维产品色泽柔和、无毒无害、色彩自然，是高档天然緑色纺织材料。家蚕天然彩色茧丝纤维生产过程不需要染色，能够有效减少丝绸印染的污染，对环境和人体友好，具有重大经济利用价值和重要的社会发展意义。但近百年来，彩色茧原料生产一直未能解决茧色杂、易褪色、丝质差、丝量低和茧形不正等茧丝纤维特性的重大缺陷，家蚕彩色茧精细化加工技术也因为完全没有合格的原料苗，无法开展技术研究与突破，存在无法纺制细纤高档天然彩色丝线、无法生产高档面料的行业技术瓶颈。因此迫切需求创新天然彩色茧品种培育方法，提高选择的准确性，加快天然彩色茧品种选育速度。家蚕形成茧色的物质来源于幼虫取食的桑叶(饲料)，桑叶中的天然色素在体内与色素转运蛋白结合后，才能够被家蚕消化道吸收，并进一步通过血液转移进入丝腺，最終形成有色茧。家蚕同样取食桑叶，能够结出不同顔色的蚕茧，甚至是白色茧，其根本的原因是家蚕体内在色素吸收与转运过程中对色素的保护与加工能力差异所致。经典遗传学分析已经鉴定出近20个控制家蚕茧色的基因，因此茧色的遗传相当复杂，不仅有些种类的黄色茧与緑色茧很难分辨，同样是黄色茧也存在多种遗传类型，甚至还有外层黄色茧与内层黄色茧等差别，仅仅凭茧色无法保证遗传基因的纯合，也很难通过杂交分离纯化，这直接影响有色茧实用品种的选育和杂交Fl代的利用。类胡萝卜素、叶黄素及黄酮色素也是亚洲人类血液中大量存在的色素，它在动物体内具有抗氧化、影响繁殖性能、參与机体免疫反应等功能。鸟类就具有在蛋中沉积类胡萝卜素的习惯，沉积的色素能够促进胚胎发育和孵化。目前为止，包括人类在内，动物对类胡萝卜素相关色素的吸收与转运机制都还不清楚，其调控基因的研究只是參考家蚕这ー实验动物数据。因此，发现和应用分子水平的鉴别基因和分子标记方法具有生物医学的实践意义。1996年，Jouni和Wells报道了一个分离自家蚕中肠的叶黄素结合蛋白(Luteinbinding protein, LBP),但目前还没有其序列及功能的深入报道。Tabunoki H等(2002)，Tsuchida 等(2004)，Sakudoh 等(2005，2007)，牛艳山等(2010)报道了一个家蚕类胡萝卜素结合蛋白(Carotenoid binding protein, CBP),其与类胡萝卜素特别是叶黄素(Lutin)的吸收、转运密切相关，并克隆和功能鉴定了该基因。CBP作为胞质溶胶中的类胡萝卜素载体与C基因编码的CAME02蛋白作为细胞表面的跨膜受体协同作用，共同介导类胡萝卜素的运输(Sakudoh et al.，2010)。家蚕Cbp基因位于功能还不清楚的BmStartl基因位点，由7个外显子和6个内含子构成，第2外显子序列完整性与黄色茧形成有夫，第2外显子序列缺失的原因，可能是一个反转录转座子CATS(CBP_associated TRAS-Iike sequence),针对Cbp第2内含子的插入导致基因重排，结果使第2外显子3'端序列和第2内含子及CATS 5'端序列的删除，导致Cbp基因具有多于4种基因结构，这个基因内的重排过程影响黄茧和白茧品种的形成。
在对多个家蚕茧色系统(品种)Cbp基因和3种Cbp-Iike基因结构比较分析的基础上，结合它们的丝腺色素与茧色的分析发现家蚕Cbp基因的翻译蛋白质产物CBP是家蚕黄色茧形成过程中色素转运的关键因子，只存在于家蚕黄色茧品种4龄与5龄幼虫的丝腺等组织，但家蚕Cbp基因和Cbp-Iike基因及其转录RNA产物存在于各种茧色的家蚕体内。家蚕黄色茧品种的Cbp基因和Cbp-Iike基因能够同时转录具有CBP功能性的完整mRNA和缺少第2外显子的mRNA ;绿茧品种和白茧蚕品种的Cbp基因和Cbp-Iike基因都只能转录缺少第2外显子的mRNA (牛艳山，2010)。目前，国内外家蚕有色茧品种选育使用的方法是依靠茧色评估和选留家系与个体，而由于前述的黄红系列茧色无法判断纯合和杂合家系，另外对茧层内外顔色的一致性和色牢度高家系和个体的选择只能通过蚕茧颜色测定和茧丝色牢度检测才能够实现，导致黄红茧系蚕品种的选育工作缺乏准确性，选育的品系很难稳定茧色，育种周期长、成本高、效果差。虽然理论上通过检验Cbp基因和Cbp-Iike基因转录的mRNA结构，或者检测CBP蛋白质产物，可以确认检测个体的类胡萝卜素结合蛋白基因类型，但家蚕Cbp基因和Cbp-Iike基因主要在5龄幼虫丝腺和消化管转录表达，鉴定Cbp基因和Cbp-Iike基因转录和表达产物类型需要杀死幼虫取出丝腺或消化管组织，无法同时实现鉴定基因类型与留种两全，而且也无法从蚕茧茧层顔色有差异、色度也有差异的黄红色茧系统的混合群体鉴别和分离出茧层颜色内外一致、色牢度高的家系，不能满足天然彩色茧品种育种工作的需要。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供ー种利用家蚕Cbp基因和Cbp-Iike基因转录的mRNA的特异序列，在幼虫期快速、准确、特异性鉴别家蚕吐丝颜色的方法。为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案ー种在幼虫期鉴定家蚕吐丝颜色的方法，为提取待测家蚕丝腺RNA，反转录方法合成cDNA，以获得的cDNA为模板用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO 2所示核苷酸序列的下游引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，判断家蚕吐丝颜色；
若仅具有一条SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列或者同时具有SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列或其互补序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列，则家蚕吐黄色茧丝；若仅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。家香基因转录的mRNA和翻译的蛋白质序列，虽然依赖于该基因的外显子序列,但其内含子序列和顺式调节子等其它序列有时也影响基因转录的mRNA和翻译的蛋白质序列。家蚕的BmStartl基因位点是一个复杂的多基因重叠位点，Cbp基因是其中I个重叠基因。豕香的Cbp基因重置范围内的DNA有4种不同序列，这种DNA序列的差异，既有Cbp基因外显子的序列差异，也有影响Cbp基因mRNA转录本的内含子序列差异，导致在结不同颜色蚕茧的家蚕的色素吸收和储存组织的Cbp基因和Cbp-Iike基因mRNA转录本有4种不同序列，翻译的蛋白质序列和功能也有差异。Cbp基因重置范围内的DNA序列虽然变化很多，但其中存在能够区分结黄色茧家蚕与结其它颜色茧家蚕的特异序列。本发明利用家蚕Cbp基因和Cbp-Iike基因转录的mRNA的特异序列，在幼虫期快速、准确、特异性鉴别家蚕吐丝颜色。 在一个具体实施方式
中，本发明提取5龄期家蚕丝腺RNA，反转录合成cDNA，以获得的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物，进行RT-PCR扩增，扩增家蚕特征序列，琼脂糖电泳检测RT-PCR扩增产物，结果显示RT-PCR扩增产物仅具有一条SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者同时具有SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，家蚕吐黄色茧丝；RT-PCR扩增产物仅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。肌动蛋白基因3 (Actin3)，属于ARP家族Actin亚家族，在家蚕不同组织及发育时期Actin3基因表达基本稳定，因此Actin3基因是家蚕分子生物学研究中常用内参基因之一。本发明以Actin 3基因作为内参基因，通过用凝胶自动成像系统分析RT-PCR扩增产物的电泳凝胶产物与Actin 3基因的相对含量，判断家蚕吐绿色茧丝还是白色茧丝，结果显示具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内参基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值> O. 8，家蚕吐绿色茧丝；具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内参基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值< O. 4，家蚕吐白色茧丝。本发明进一步通过用凝胶自动成像系统分析RT-PCR扩增产物的电泳凝胶产物的相对含量判断家蚕为纯合型吐黄色茧丝还是杂合型吐黄色茧丝，结果显示，具有SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 3，家蚕为纯合型吐黄色茧丝，即家蚕全部吐黄色茧丝；具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值< 3，家蚕为杂合型吐黄色茧丝，即家蚕部分吐黄色茧丝，蚕茧外层为黄色，内层为白色。在另一实施例中，本发明通过用凝胶自动成像系统分析RT-PCR扩增产物的电泳凝胶产物的相对含量从茧层颜色有差异、色度也有差异的混合群体鉴别分离出茧色内外一致、色牢度高的家系。结果显示具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 5则家蚕吐黄色茧丝的色度高和色牢度高。本发明所述鉴别家蚕吐丝颜色的方法准确率为100%。本发明所述方法可以在幼虫阶段判定蛾区后代是否为色度高和色牢度高的纯合型吐黄色茧丝，不需经过3代以上的蛾区内自交，极大的減少了育种过程中的饲养工作量及饲养成本。为了获得丝量多、丝质优、抗性强彩色茧丝，人们通常将家蚕黄色茧纯系Y12与家蚕丝量多、丝质优、抗性强的纯系白色茧优秀蚕品种JS杂交，Fl代蚕茧全部为黄色，F2代出现黄色与白色两种蚕茧，其中黄色茧中有茧色分离与茧色不分离两种个体，这种茧色分离的个体现有方法无法剔除干净。目前采用的方法是将上述F2代黄色茧与黄色茧纯系Y12回交，毎回交一代，黄色茧中有茧色分离的个体数減少一半，但理论上永远不会将茧色分离的个体剔除干净，至回交第3代的黄色茧中有茧色分离的个体数仍然有1/16，而且此时黄色茧的丝量、丝质和抗性会迅速回落。在一个实施例中，本发明采用鉴别出的色度高和色牢度高的纯合型吐黄色丝的家蚕与白色茧优秀品种组合的杂交，获得丝量多、丝质优、抗性 强、内外颜色一致的黄色苗系统。本发明还提供了ー种在幼虫期鉴定家蚕吐丝颜色的试剂盒，包括具有SEQ ID NO I所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。在一些实施例中，本发明所述鉴定家蚕吐丝颜色的试剂盒还包括PCR扩增反应缓冲液、dNTP、Taq酶中的ー种或几种。本发明还提供了ー种在幼虫期鉴定家蚕吐丝颜色的DNA分子组，由SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列組成。本发明提供了一种鉴定家蚕吐丝颜色的方法。本发明所述方法利用基因工程技术提取待测5龄期家蚕丝腺RNA，反转录合成cDNA，以获得的cDNA为模板，用特异引物进行RT-PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的种类和长度判断家蚕吐黄色茧丝还是吐緑色或白色茧丝，并且通过分析RT-PCR扩增产物的电泳凝胶产物的相对含量进ー步判断吐黄色茧丝的家蚕为纯合型吐黄色茧丝还是杂合型吐黄色茧丝，其他家蚕吐绿色茧丝还是白色茧丝。本发明所述方法还可以从茧层顔色有差异、色度也有差异的混合群体鉴别分离出茧色内外一致、色牢度高的家系。本发明所述鉴别方法操作简便快速，鉴别家蚕吐丝颜色准确性高。同时鉴别出的色度高和色牢度高的纯合型吐黄色丝的家蚕还可与白色茧优秀品种组合的杂交，获得丝量多、丝质优、抗性强、内外顔色一致的黄色茧系统。
具体实施例方式本发明实施例公开了ー种鉴别家蚕吐丝颜色的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进エ艺參数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技木。为了进一歩理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。实施例I :为了从4个家蚕5龄幼虫样本鉴别出茧色黄緑色的绿色茧系统大造品种、茧色纯白色的白色苗品种C108、苗色黄色的黄色苗系统彩苗I号品种和外层黄苗品种Y0，本实施例进行了如下的步骤(I)分别以商用RNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取上述4个5龄幼虫样本的丝腺的总RNA，分别反转录方法合成cDNA，-20°C至_40°C保存待用。反转录采用TaKaRa公司的反转录试剂盒，反转录反应体系(10 μ L): 5 X PrimeScript Buffer 2 μ L ；PrimeScript EnzymeMixI O. 5 μ L ；50 μ mol/L Oligo dT Prime (50 μ mol/L) O. 5 μ L ；Total RNA I μ L ；加RNase FreeH2O至总体积10 μ L。反转录的条件为37°C 15min ；85°C 5s。(2)以步骤(I)获得的4种家蚕cDNA为模板，用具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物，以Actin 3基因作为内参基因，采用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)，在Bio-RadChromo4仪器上，按照说明书进行RT-PCR扩增，反应体系25 μ L，每个样品重复检测3次。其中Act in 3基因的上游引物序列为5’ -CCCCATCGAACACGGAATCG-3’，下游引物为5’-CGCTCGGCAGTGGTAGTGAA-3’ ；RT_PCR 扩增的反应条件为95°C 5s ；60°C IOs ；72°C 10 ；32 个循环。(3)以加入EB的I. 2%琼脂糖电泳检测步骤(2)获得的4个样本的RT-PCR扩增产物的种类与序列长度，以200bp DNA Ladder为序列长度标记。(4)紫外光条件下观察步骤(3)电泳凝胶，除内参基因Actin 3的I条产物条带夕卜，样本2和样本3的电泳泳道中都只有I条长度268bp的产物；样本I和样本4的电泳泳道中同时都具有I条长度268bp的产物和I条长度577bp的产物。将4个幼虫样本从步骤(3)电泳凝胶获得的268bp的产物和577bp的产物分别用PCR Clean-up kit回收，克隆测序后结果为样本I来源的268bp的产物，3个克隆有2个克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I个克隆与具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列仅有I个碱基的差异。样本I号来源的577bp的产物，3个克隆有I个克隆具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，有I个克隆与具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列仅有I个碱基的差异，另I个克隆与具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列仅有2个碱基的差异。样本2来源的268bp的产物，3个克隆中有2个克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I个克隆与具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列仅有I个碱基的差异。样本3来源的268bp的产物，3个克隆中有2个克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I个克隆与具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列仅有2个碱基的差异。样本4来源的268bp的产物，3个克隆有2个克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I个克隆与具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列仅有I个碱基的差异。样本4号来源的577bp的产物，3个克隆有I个克隆与具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列仅有I个碱基的差异，另2个克隆与具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列仅有2个碱基的差异。将4个样本剩余幼虫继续分别饲养至吐丝结茧，样品I和样品4吐黄色茧丝。因此判定若仅具有一条SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者同时具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，则家蚕吐黄色茧丝；若仅具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。(5)用凝胶自动成像系统 Tanon 2500, Tanon GIS (Gel Image System)软件分析步骤(3)各样本的电泳凝胶产物的相对含量，结果样本2的长度268bp的产物电泳条带的光密度值与内參基因Actin 3产物电泳条带的光密度值的比值为1.2 ;样本3的长度268bp的产物电泳条带的光密度值与内參基因Actin A3产物电泳条带的光密度值的比值为O. 3 ；样本I的长度577bp的产物电泳条带的光密度值高于长度268bp的产物电泳条带的光密度值11. 2倍；样本4的长度577bp的产物电泳条带的产物的光密度值高于长度268bp的产物电泳条带的光密度值2. 3倍。观察饲养的4个样本剰余幼虫所结的茧评判家蚕品种，样本I为全部吐黄色茧丝的黄色茧系统彩茧I号品种；样本2为吐绿色茧丝的绿色茧系统大造品种；样本3为吐白色茧丝的白色茧系统C108品种；样本4为吐部分黄色茧丝的外层黄茧品种Y0。因此判定若家蚕具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内參基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值> O. 8，则家蚕吐绿色茧丝；若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内參基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值彡O. 4，则家蚕吐白色茧丝。若家蚕具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条与具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 3则家蚕为纯合型吐黄色茧丝。实施例2从茧层顔色有差异、色度也有差异的混合群体鉴别分离出茧色内外一致、色牢度闻的家系。(I)以单蛾区饲养，5龄期从100个蛾区中每蛾区各取一定数量的幼虫样本，按实施例I所述方法从每条幼虫丝腺提取的总RNA，按实施例I所述方法反转录方法合成cDNA，-20°C至 _40°C保存备用。(2)以步骤(I)提取的各蛾区家蚕丝腺cDNA为模板，用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物，以Actin 3基因作为内參基因，按照实施例I所述方法RT-PCR扩增。(3)以加入EB的I. 2%琼脂糖电泳检测步骤(2)获得的各蛾区幼虫样本的RT-PCR扩增产物，以200bp DNA Ladder为序列长度标记。(4)紫外光条件下观察步骤(3)电泳凝胶，除内參基因Actin 3的I条产物条带夕卜，选出电泳泳道中只有I条长度577bp的具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的产物的样本，这类样本记为“ + ”；(5)对步骤(4)紫外光条件下观察到的泳道中除内參基因Actin 3的I条产物条带外，还同时具有I条长度268bp的具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的产物和I条长度577bp的具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的产物的样本，用凝胶自动成像系统Tanon2500, Tanon GIS (Gel Image System)软件分析各样本的电泳凝胶产物的相对含量,结果出现3种类型类型I为样本的SEQ ID NO. 4产物的光密度值高于SEQ ID NO. 3的光密度值3倍至5倍，这类样本记为“ + ”类型2为样本的SEQ ID NO. 4产物的光密度值高于SEQ ID NO. 3的光密度值5倍以上，这类样本记为“++”类型3为样本的SEQ ID NO. 4产物的光密度值高于SEQ ID NO. 3的光密度值小于3倍，这类样本记为
(6)统计各蛾区中所有样本的步骤(4)或步骤(5)中的类型，选择没有类型的蛾区留种，共选出3号、23号、27号、39号、61号和89号6个蛾区，其中3号蛾区的“++”类型比例高于80%。系统选育后结果，这6个蛾区中没有出现其他颜色的蚕茧，蚕茧的内外茧层颜色都为黄色，表明本发明所述鉴别家蚕吐丝颜色的方法准确率为100%。其中3号蛾区的后代生丝颜色金黄色、色牢度高于其它5个蛾区的茧丝。因此判定，若具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 5则家蚕吐黄色茧丝的色度高和色牢度高。本发明所述方法不需经过3代以上的蛾区内自交即可判定蛾区后代是否为纯合型吐黄色茧丝，可以减少5龄后期94%的饲养量。实施例3从纯合型吐黄色丝的家蚕与白色茧优秀品种的配种中筛选纯合型吐黄色丝家蚕。 (I)将家蚕黄色茧纯系Y12与家蚕丝量多、丝质优、抗性强的纯系白色茧优秀蚕品种JS杂交，Fl代自交得到的F2代以单蛾区饲养，5龄期从全部幼虫的血液都为黄色的100个蛾区各取一定数量的幼虫样本，按实施例I所述方法从每条幼虫丝腺提取的总RNA，按实施例I所述方法反转录方法合成cDNA，-20°C至_40°C保存备用。(2)以步骤(I)提取的各蛾区家蚕丝腺cDNA为模板，用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物，以Actin 3基因作为内参基因，按照实施例I所述方法RT-PCR扩增。(3)以加入EB的I. 2%琼脂糖电泳检测步骤(2)获得的各蛾区幼虫样本的RT-PCR扩增产物，以200bp DNA Ladder为序列长度标记。(4)选择蛾区中每条幼虫来源的步骤(3)电泳检测的RT-PCR扩增产物的种类都同时具有I条长度268bp的SEQ ID NO. 3产物和I条长度577bp的SEQ ID NO. 3的产物，结果共选出99个蛾区。(5)用凝胶自动成像系统 Tanon 2500, Tanon GIS (Gel Image System)软件分析各样本的电泳凝胶产物的相对含量，计算同一个电泳泳道中电泳条带SEQ ID NO. 4产物与SEQ ID NO. 3产物的相对光密度值比值，选出蛾区中每条幼虫样本的该比值大于2. O的蛾区，结果从步骤(4)的99个蛾区中共选出41个蛾区。(6)继续饲养步骤(5)选出的41个蛾区的幼虫，系统选育方法获得了丝量、丝质和抗性显著高于家蚕黄色茧纯系Y12的稳定遗传的黄色茧品种，与选配的白色茧优秀品种杂交，获得丝量多、丝质优、抗性强、内外颜色一致的黄色茧系统。本发明所述方法不需经过反复与Y12回交，可以缩短育种时间和成本50%以上，本发明所述方法也不会出现育成品种的茧色不纯所带来的生产效率低和品种认定困难的问题。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种在幼虫期鉴别家蚕吐丝颜色的方法，其特征在于， 提取待测5龄期家蚕丝腺RNA，反转录方法合成CDNA，以获得的cDNA为模板用具有SEQID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，判断家蚕吐丝颜色； 若仅具有一条SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列，或者同时具有SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列或其互补序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列，则家蚕吐黄色茧丝；若仅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。
2.根据权利要求I所述鉴别方法，其特征在于，还包括与具有SEQID NO 5所示的核苷酸序列内参基因ActinA3的RT-PCR扩增产物光密度值比较，判断家蚕吐绿色茧丝还是白色苗丝； 若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内参基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值> O. 8，则家蚕吐绿色茧丝；若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值与内参基因Actin 3电泳条带的光密度值的比值彡O. 4，则家蚕吐白色茧丝。
3.根据权利要求I所述鉴别方法，其特征在于，还包括利用具有SEQID N0:4所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值，判断家蚕为纯合型吐黄色茧丝还是杂合型吐黄色茧丝； 若具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 3则家蚕为纯合型吐黄色茧丝。
4.根据权利要求I所述鉴别方法，其特征在于，利用具有SEQID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值，判断家蚕吐黄色茧丝的色度和色牢度； 若具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带与具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补序列的RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度比值> 5则家蚕吐黄色茧丝的色度高和色牢度高。
5.—种在幼虫期鉴别家蚕吐丝颜色的试剂盒，其特征在于，包括具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
6.一种在幼虫期鉴别家蚕吐丝颜色的DNA分子组，其特征在于，由具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补序列的DNA分子和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补序列的DNA分子组成。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种在幼虫期鉴定家蚕吐丝颜色的方法。本发明所述方法利用基因工程技术提取待测5龄期家蚕丝腺RNA，反转录合成cDNA，以获得的cDNA为模板，用特异引物进行RT-PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的种类和长度判断家蚕吐黄色茧丝还是吐绿色或白色茧丝，并且通过分析RT-PCR扩增产物的电泳凝胶产物的相对含量进一步判断吐黄色茧丝的家蚕为纯合型吐黄色茧丝还是杂合型吐黄色茧丝，其他家蚕吐绿色茧丝还是白色茧丝。本发明所述方法还可以从茧层颜色有差异、色度也有差异的混合群体鉴别分离出茧色内外一致、色牢度高的家系。本发明所述鉴别方法操作简便快速，鉴别家蚕吐丝颜色准确性高。
文档编号C12N15/11GK102808033SQ20121031221
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者徐世清, 牛艳山, 司马杨虎, 陈息林, 殷为民, 袁红霞, 邢瑞 申请人:苏州大学