专利名称：一种奶山羊plzf基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及生殖细胞自我更新相关基因，特别涉及一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用。
背景技术：
哺乳动物的精子发生包括精原干细胞(雄性生殖干细胞)的增殖、分化、发育等一系列细胞形态和生理功能的改变，最终生成精子的整个过程。其中雄性生殖干细胞的自我更新是精子发生过程中的关键步骤，也是雄性动物终生产生精子的基础。PLZF是POZ家族的新成员，是人类精子发生过程自我更新的关键调控因子，在睾丸组织特异性表达。PLZF是一个近期被人们发现并重视的新基因(Buaas Fff, Kirsh AL，Sharma M，McLean DJj Morris 几，Griswold MD，de Rooij DGj Braun RE. PLZF isrequired in adult male germ cells for stem cell self-renewal. Nature genetics2004，36(6):647-52;Costoya JA，Hobbs RMj Barna M，et al. Essential role of PLZF inmaintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics 2004，36(6):653-9.)。PLZF即早幼粒细胞白血病锋指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger),是由中国学者在国际上首次发现并克隆的基因，亦是我国学者在国内自行发现的第一个人类疾病相关基因(Chen Zj Brand NJj Chen A, Chen SJj Tong JHj Wang ZYj Waxman S，ZelentA.Fusion between a novel Kruppel-Iike zinc finger gene and the retinoicacid receptor-alpha locus due to a variant t (11;17)translocation associatedwith acute promyelocytic leukaemia. The EMBO Journal 1993，12(3):1161-7;ChenSJjZelent A，Tong JHjet al. Rearrangements of the retinoic acid receptor alphaand promyelocytic leukemia zinc finger genes resulting from t (11;17) (q23;q21)in a patient with acute promyelocytic leukemia. The Journal of ClinicalInvestigation 1993，91 (5):2260-7.)。PLZF功能的缺失扰乱了精原干细胞(SSCs)增殖与分化之间的平衡，使之由增殖转向分化。PLZF为成年雄性动物的精原干细胞自我更新所必需的，PLZF有助于精原干细胞在雄性生殖腺中驻留。PLZF定向敲除导致雄性不育，PLZF在单个、成对或结成链状的未分化的精原细胞中均有表达(Buaas Fff, Kirsh AL, Sharma M, et al. PLZF is required inadult male germ cells for stem cell self-renewal. Nat Genet 2004, 36:647-652. X干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。已有研究证实干细胞可以在体外分化为早期生殖细胞，甚至进一步分化为卵母细胞或精子(HUbnerK，Fuhrmann G，Christenson LKj et al. Derivation of oocytes from mouse embryonicstem cells[J]. Science，2003，300:1251 - 1256;Geijsen N，Horoschak M，Kim K，etal. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stemcells[J]. Nature, 2004，427:148 - 154.)。
虽然至今建立了多种用于雄性生殖干细胞体外增殖和分化的研究体系，Knockout实验也发现了许多调控自我更新的关键基因和蛋白，但是还不能完全实现建立体外进行自我更新和精子发生的研究模型，体外很难控制雄性生殖干细胞自我更新的起始。因此，通过构建一些增殖多能性关键基因的真核表达载体，利用其修饰体外培养雄性生殖干细胞，探索功能基因之间的关系，发现相关调控自我更新的信号途径，进而揭示自我更新过程基因之间相互作用的分子机制具有重要的科学意义。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用，将外源PLZF基因转染雄性生殖干细胞可促其进行自我更新，可研究PLZF对雄性生殖干细胞特异基因表达的调控作用。本发明是通过以下技术方案来实现 一种奶山羊PLZF基因，该基因序列如SEQ. ID. NO. I所不。一种奶山羊PLZF基因，其基因的CDS序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 一种奶山羊PLZF基因的融合基因，在奶山羊PLZF基因的下游连接荧光报告基因。所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。一种基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因 IcanYneolrtj所述的基于PLZF基因序列构建的表达载体为pPLZF-IRES2-EGFP表达载体，通过Ecor I和BamH I酶切位点将PLZF基因克隆到pIRES2_EGFP表达载体。奶山羊PLZF基因序列转染到雄性生殖干细胞中以促进雄性生殖干细胞自我更新的应用。一种促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，包括以下步骤I)克隆如SEQ. ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并将PLZF基因序列通过Ecor I和BamH I酶切位点克隆到pIRES2_EGFP表达载体中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表达载体；2)将待转染的奶山羊雄性生殖干细胞与PPLZF-IRES2-EGFP表达载体共同孵育，将pPLZF-IRES2-EGFP表达载体转染到雄性生殖干细胞之中；转染后3 4h，将奶山羊雄性生殖干细胞在基本培养基上添加其体积10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巯基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺进行培养；所述的基本培养液为DMEM/F12培养液或H-DMEM培养液；并在荧光显微镜下对荧光标记基因进行观察，筛选启动自我更新相关基因表达水平增高的细胞。还以人的293T细胞的转染作为对照，该细胞所采用的基本培养液为H-DMEM培养液。所述的启动自我更新相关基因为PCNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果
I、本发明克隆了奶山羊的PLZF基因，其CD区大小为2022bp(SEQ. ID. NO. 2)，在其CDS序列的保守性达90%以上；该基因可促进雄性生殖干细胞自我更新。2、本发明在克隆奶山羊的PLZF基因的基础上，构建了 pPLZF_IRES2_EGFP重组载体，利用PPLZF-IRES2-EGFP重组载体转染细胞，转染后，随时间延长，表达GFP的细胞数增多。pPLZF-IRES2-EGFP转染293T后，细胞形态也未发生显著变化，但是增殖和多能性 标记基因的表达水平略有上调，表明细胞有进入自我更新的趋势；转染奶山羊雄性生殖干细胞后，细胞形态发生显著变化，启动自我更新相关基因的表达水平显著增高。
图I是PCR扩增的PLZF基因的琼脂糖凝胶电泳图；图2是Ecor I和BamH I双酶切鉴定阳性重组载体pPLZF_IRES2_EGFP ；图3是奶山羊PLZF基因⑶S序列与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠、山羊等物种序列比较所构建的系统进化树；图4是荧光显微镜观察重组载体pPLZF-IRES2-EGFP在293T细胞的表达；图5是荧光显微镜观察重组载体PPLZF-IRES2-EGFP在奶山羊雄性生殖干细胞的表达后增殖多能性基因的表达；图6是奶山羊雄性生殖干细胞转染pPLZF-IRES2-EGFP 48h后生殖细胞特异性标记基因表达的RT-PCR结果。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、奶山羊PLZF基因的克隆及载体构建首先提取奶山羊睾丸组织总RNA，反转录试剂盒得到cDNA，作为扩增的模板；用电子克隆技术结合Primer Premier 5. O引物设计软件设计扩增引物,并选择合适的限制性内切酶，具体设计以下引物上游引物RRtRaattCRCCRRtRRtRatttRCtaaC下游引物attRRatccccatcRcttctcctcctRct上游引物中划线部分为Ecor I酶切位点，下游引物中下划线部分为BamH I酶切位点；PLZF基因PCR扩增反应体系为15 μ L，其中包括10Xbuffer I. 5 μ L，MgCl2(25mmol/L) I. 6μ L, dNTP (2. 5mmol/L) I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0· I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 O. 5 μ L, ddH20 9· 5 μ L。反应程序94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸90s，共35个循环，最后72°C补延伸10min，4°C保存。回收并纯化PCR产物，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约2320bp (检测结果如图I所示)处出现特异性扩增条带，得到奶山羊的PLZF基因；然后将PCR产物、pIRES2-EGFP真核表达载体(Addgene)分别用Ecor I和BamH I双酶切后连接，将PLZF基因克隆入pIRES2_EGFP真核表达载体，构建重组载体PPLZF-IRES2-EGFP。将重组载体pPLZF-IRES2-EGFP进行Ecor I和BamH I双酶切鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，双酶切鉴定结果如图2所示，在2320bp和5300bp处出现目的条带，也即克隆到的PLZF基因目标片段和酶切之后剩余的PIRES2-EGFP载体骨架。通过挑取多个单克隆酶切验证后测序，大小和序列一致，测序后得到PLZF基因序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。将奶山羊PLZF基因中的⑶S序列，如SEQ. ID. NO. 2所示(⑶S序列是编码一段蛋白产物的序列，各物种之间CDS区的高度相似，也就意味它们翻译出的蛋白所构成的氨基酸更为相似，发挥的功能也更为相似，即蛋白的功能更为保守)。与GenBank上公布的人、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠等物种的PLZF基因⑶S序列比较，用DNAMAN软件进行比对，构建系统进化树，结果如图3所示。生物信息学分析表明PLZF基因的CDS序列在多个物种高度保守，也就是说PLZF蛋白在各物种中的功能较为保守。 2、重组载体的转染及转染后细胞的观察将处于对数生长期的293T细胞及奶山羊雄性生殖干细胞用O. 25%胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，接种到铺有明胶的24孔培养板中。培养细胞至约70%时融合，按照Fermentas公司的TurboFect 转染说明书分别进行pPLZF_IRES2_EGFP重组载体的转染。具体为将2μ g载体加入300μ I opti-MEM培养液中，再加入4 μ I TurboFect转染试齐[J，温和混匀。室温孵育20min后，将TurboFect/DNA混合物均匀加入培养皿内。转染后3-4h, 293T的培养基更换为H-DMEM+0. lmmol/L β -巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%体积浓度的胎牛血清培养；奶山羊雄性生殖干细胞的培养基更换为DMEM/F12+0. lmmol/L β -巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%体积浓度的胎牛血清。转染后，在荧光显微镜下，293T和奶山羊生殖细胞中均观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。随时间延长，表达GFP的细胞数增多。pPLZF-IRES2-EGFP转染293T(图4)后，细胞形态并未发生显著变化，但只有转染了 PLZF重组载体的细胞出现GFP绿色荧光，并且在这些细胞中能检测到PLZF的表达(图4e-g)，表明所构建的重组载体pPLZF-IRES2-EGFP能顺利转染293T细胞并表达PLZF蛋白。图4中的对照转染pIRES2-EGFP的293T，分别为在明场和荧光显微镜下的观察结果；图4中转PLZF中无荧光点的图为未转进去的293T，出现荧光点的图为转染PLZF重组载体的293T细胞。pPLZF-IRES2-EGFP重组载体转染奶山羊雄性生殖干细胞后，荧光观察结果如5所示，细胞形态发生显著变化，转染重组载体的细胞为上皮样，对照组细胞呈纤维状。图5提示转了 PLZF后细胞启动自我更新相关基因PCNA、C-MYC、0CT4、PLZF的表达水平显著增高。所述的自我更新、增殖多能性以及周期相关基因采用RT-PCR来检测，扩增反应体系为 15 μ L :其中包括10 X buffer I. 5 μ LjMgCl2 (25mmol/L) I. 6 μ L，dNTP (2. 5mmol/L)I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0. I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 0· 5 μ L，ddH20 9. 5 μ L0
反应程序94°C预变性5min，94°C变性30s，退火30s，72°C延伸90s，共35个循环，最后72°C补延伸10min，4°C保存。RT-PCR检测结果如图6所示，转染pPLZF-IRES2-EGFP的细胞较未转染的对照细胞 的卩0應、0]^(、0(^4、？1^ 、0)1(2、0￥(1嫩1的表达水平显著增高。说明PLZF基因可作用于一系列增殖和多能性的基因表达，进而促进哺乳动物生殖干细胞的自我更新。
权利要求
1.一种奶山羊PLZF基因，其特征在于，其基因序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.一种奶山羊PLZF基因，其特征在于，该基因的⑶S序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.一种奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，在奶山羊PLZF基因的下游连接荧光报告基因。
4.如权利要求3所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。
5.一种基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，其特征在于，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因⑶S序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因kanVnec/。
6.如权利要求5所述的基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，其特征在于，所述的基于PLZF基因序列构建的表达载体为pPLZF-IRES2-EGFP表达载体，通过Ecor I和BamHI酶切位点将PLZF基因克隆到pIRES2-EGFP表达载体。
7.奶山羊PLZF基因序列转染到奶山羊雄性生殖干细胞中以促进其自我更新的应用。
8.一种促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)克隆如SEQ.ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并将PLZF基因序列通过Ecor I和BamH I酶切位点克隆到pIRES2_EGFP表达载体中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表达载体； 2)将待转染的奶山羊雄性生殖干细胞与pPLZF-IRES2-EGFP表达载体共同孵育，将PPLZF-IRES2-EGFP表达载体转染到雄性生殖干细胞之中； 转染后3 4h，将奶山羊雄性生殖干细胞在基本培养基上添加其体积10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巯基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺进行培养；所述的基本培养液为DMEM/F12培养液或H-DMEM培养液； 并在荧光显微镜下对荧光标记基因进行观察，筛选启动自我更新相关基因表达水平增高的细胞。
9.如权利要求8所述的促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，还以人的293T细胞的转染作为对照，该细胞所采用的基本培养液为H-DMEM培养液。
10.如权利要求8所述的促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，其特征在于，所述的启动自我更新相关基因为PCNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。
全文摘要
本发明公开了一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用，该基因的CDS序列如SEQ.ID.NO.1所示。基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，包含SEQ.ID.NO.1所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因kanr/neor。奶山羊PLZF基因序列转染到雄性生殖干细胞中以促进雄性生殖干细胞自我更新的应用。
文档编号C12N15/63GK102888407SQ20121037673
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者宋文聪, 华进联 申请人:西北农林科技大学