一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸,多次进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测霍乱弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【专利说明】一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，具体的说，是一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法。
【背景技术】 [0002]霍乱(cholera)是一种烈性肠道传染病，两种甲类传染病之一，由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)污染水和食物而引起传播。临床上以起病急骤、剧烈湾吐、排泄大量米泔水样肠内容物、脱水、肌痉挛少尿和无尿为特征。霍乱弧菌的感染源主要为受污染的饮食为主，快速检测饮食中的霍乱弧菌，对预防食物中毒以及确定有效治疗方案具有很大意义。
[0003]环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对霍乱弧菌特异性基因序列的一对外引物(V-F3和V -B3)和一对内引物(V -FIP和V -BIP)进行环介导等温扩增。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。
[0005]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，包括以下步骤:
步骤1)制备反应液反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱1M
10mM d-NTP 混合液400 μ Μ
内引物
V-FIP40umol
V-BIP40umol
外引物
V-F35umol
V-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;
步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
[0006]进一步的，所述外引物V-F3的序列为CTGCTAACGTTGGCTTTG。
[0007]进一步的，所述外引物V-B3的序列为GGCTTTATTTTCGAAATAGGGC。
进一步的，所述内引物V-FIP的序列为 CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGTo
[0008]进一步的，所述内引物V-BIP 的序列为 AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。
[0009]
进一步的，所述反应液中加入突光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测霍乱弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。 【具体实施方式】
[0011]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0012]一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
V-FIP40umol
V-BIP40umol
外引物
V-F35umol
V-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
[0013]选取霍乱弧菌的特异性基因astA (基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI)，设计引物序列。所述外引物V-F3的序列为CTGCTAACGTTGGCTTTG，所述外引物V-B3的序列为GGCTTTATTTTCGAAATAGGGC，所述内引物V-FIP的序列为
CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGT,所述内引物 V-BIP 的序列为AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。
[0014]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0015]步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)使用霍乱弧菌3株的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:3株霍乱弧菌的核酸每次均为阳性，其余菌种为阴性。[0016]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤:步骤1)制备反应液反应液组成及含量为8u/ul Bst核酸聚合酶8u10X耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱1M10mM d-NTP 混合液400 μ Μ内引物V-FIP40umolV-BIP40umol外引物V-F35umolV-B35umol标本核酸20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;`步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；步骤3)使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 V-F3 的序列为 CTGCTAACGTTGGCTTTG。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 V-B3 的序列为 GGCTTTAITTTCGAAATAGGGC。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述内引物V-FIP的序列为CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGTo
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述内引物 V-BIP 的序列为 AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
【文档编号】C12Q1/68GK103725767SQ201210385900
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2012年10月12日
【发明者】金京勋 申请人:苏州市贝克生物科技有限公司